MIR-138-5p 通過靶向組蛋白去乙酰化酶調節心臟肥大

侯維納，呂愛婷，孫琪青，馮迎軍

（鄭州大學附屬兒童醫院，河南省兒童醫院，鄭州兒童醫院心內科，鄭州 450000）

心臟肥大是對重度壓力的生理反應，可使心臟功能恢復正常[1]。心肌細胞持續增大需要更多的氧氣，而冠狀動脈的血液供應不足，可導致心力衰竭甚至猝死[2]。盡管越來越多的文獻研究了調節心臟肥大的分子靶點，但其詳細的分子機制尚未全面了解。

MicroRNA（miRNA）是約19～25 個核苷酸的保守非編碼單鏈RNA，它們通過與靶mRNA 的3′UTR結合來抑制翻譯和（或）降解靶mRNA[3]。miRNA 通過調節其靶基因參與多種生物過程，如增殖、分化、凋亡、發育、血管生成和免疫應答[4]。如miR-142-3p是調節心臟中早期胚胎干細胞分化的重要因素，并且對心臟發育具有負面調節作用[5]。Roberto 等[6]發現MIR-138-5p 表達與骨肉瘤的預后有關；然而MIR-138-5p 在心肌肥大模型大鼠及心肌細胞中表達如何，發揮何作用尚不清楚。本研究通過成功構建壓力超負荷心肌肥大大鼠模型（TAC）和心臟肥大體外模型，探究MIR-138-5p 在肥大心肌細胞的表達，對心臟肥大反應的作用及其初步機制，希望基于MIR-138-5p 的分子機制為改善心臟肥大提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 TAC 的建立 所有動物護理和實驗均根據美國國立衛生研究院發布的《實驗動物的護理和使用指南》（NIH 出版物，2011 年修訂）和鄭州大學第一附屬醫院動物護理和使用委員會的機構指南進行。從鄭州大學第一附屬醫院實驗動物中心[SCXK（豫）2017－0001] 購買了6 周齡的成年雄性Sprague-Dawley 鼠，體重約200～250 g，共20 只，每組10 只。根據以前文獻，進行腹主動脈縮窄術。用水合氯醛（350 mg/kg，腹膜內）麻醉大鼠，開胸后，用彎頭眼科鑷輕柔分離腹主動脈，橫貫腹主動脈，然后用26 號針頭將6-0 絲線縫合在主動脈周圍，導致主動脈腔部分狹窄。在假手術組中，除沒有主動脈縫合，其余步驟與TAC 手術相同。然后將實驗分為2 組，即主動脈縮窄組（AB）和假手術組（Sham）。

1.2 組織病理學 分析手術切除左心室組織，在10%福爾馬林緩沖液中固定，石蠟包埋，切成5 μm 厚的切片。用蘇木精-曙紅染色，并在光學顯微鏡下觀察。

1.3 心肌細胞培養和實驗方案 將大鼠H9c2 心肌細胞（中國科學院，上海，中國）接種到含有10%胎牛血清（HyClone，South Logan，UT）的Dulbecco 改良的Eagle 培養基（Invitrogen，Carlsbad，CA）中，放置在37℃和5%CO2恒溫箱中培養。為了構建體外心臟肥大模型，將H9c2 細胞用濃度為1.0 mmol/L 的血管緊張素Ⅱ（AngⅡ，Sigma-Aldrich.St.Louis，MI）處理24 h，將細胞分為Con 組和AngⅡ組。

1.4 實時定量PCR 根據制造商說明書，使用TRIzol 試劑（Life.Technologies，Carlsbad，CA）從樣品中提取總RNA；cDNA 合成后（All-in-One First-Strand cDNA Synthesis 試劑盒，GeneCopoeia Inc，Santa Cruz，CA），使用MIR-138-5p 對應的引物，在ABI 75 00HT 系統（Applied Biosystems，Foster City，CA）上使用All-in-One qPCR Mix（GeneCopoeiaInc，USA）進行實時定量PCR（qRT-PCR）；β-肌動蛋白用作內部對照，進行重復反應對于每個樣品，使用2-ΔCT方法計算基因表達的相對變化；每個實驗的所有樣品一式兩份進行。

1.5 MIR-138-5p 的過表達 基因過表達質粒，包括pcDNA3.1/CCCTC 結合因子（CTCF）、pcDNA3.1/SNHG16、pcDNA3.1/IGF1 和相對陰性對照（NC，pcDNA3.1）以及MIR-183-5p 模擬物（miR-mimic）和對照模擬物（miR-NC）均購自上?；蛑扑帲ㄖ袊⒋笫驢9c2 心肌細胞接種在6 孔板中，使用補充有10%FBS 的RPMI 1640 培養基培養。使 用Opti-MEM Reduced Serum Medium（Gibco，Carlsbad，CA，USA）在第2 天當細胞豐度約60%～70%時，每個孔加入等量（200 nmol/L）的miR-mimic和miR -NC， 用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）轉染細胞。6 h 后，將培養基更換為補充有2% FBS 的RPMI 1640，轉染48 h 后，用AngⅡ處理細胞，24 h 后收集細胞，并通過定量RTPCR 或蛋白質印跡進行分析，將細胞分為Con 組（生理鹽水+生理鹽水）、AngⅡ組（1.0 mmol/L 的AngⅡ+生理鹽水）、AngⅡ+ miR-NC（1.0 mmol/L 的AngⅡ+200 nmol/L MIR-NC）、AngⅡ+ MIR-138-5pmimic 組（1.0 mmol/L 的AngⅡ+200 nmol/L MIR-138-5p- mimic），共4 組。

1.6 共轉染細胞系構建 靶向大鼠組蛋白去乙?；福℉DAC）4cDNA 的siRNA 序列由GenePharma設計和合成。siRNA 序列如下：5′-GCGGAAAUGUUAAGAGAUU-3′，合并亂序的siRNA 作為陰性對照。 編碼不含miR-138-5p 響應性3′-UTR 的全長人HDAC4 cDNA 開放閱讀框（ORF）的哺乳動物表達質粒購自Invitrogen。空質粒用作陰性對照。根據制造商的說明書，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA），將NC+pcDNA-Con、miR-138-5p-mimic+pcDNA-Con 和miR-138-5p-mimic+pcDNA-HDAC4（Sino Biological Inc.）共轉染大鼠H9c2 心肌細胞。將細胞分為Con 組（生理鹽水+生理鹽水）、AngⅡ組（1.0 mmol/L 的AngⅡ+生理鹽水）、AngⅡ+ MIR-NC（1.0 mmol/L 的AngⅡ+200 nmol/L MIR-NC）、AngⅡ+MIR-138-5p-mimic 組（1.0 mmol/L 的AngⅡ+200 nmol/L MIR-138-5p-mimic）和AngⅡ+ MIR-138-5p- mimic+ pcDNA- HDAC4（1.0 mmol/L 的AngⅡ+200 nmol/L MIR-138-5p-mimic+pcDNA-HDAC4 混合物）組，共5 組。

1.7 熒光素酶活性測定 通過PCR 擴增HDAC4基因的3′UTR 區段并插入載體中。使用Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit（Agilent）產 生破壞HDAC4 3′UTR 區域的miR-138-5p 結合位點的突變構建體。使用Lipofectamine 200（Invitrogen）將具有miR-138-5p 模擬物的HDAC4 3′UTR或mut-HDAC4 3′UTR 質粒共轉染到細胞中。轉染48 h 后，通過雙熒光素酶報告分析系統（Promega）分析熒光素酶活性。

1.8 免疫熒光（IF）染色 首先將固定在4%甲醛中的心肌細胞在0.1%Triton X-100 中滲透45 min，然后在4℃下用α-actinin 抗體（Abcam，Cambridge，UK）處理過夜。與二抗孵育1 h 后，將H9c2 細胞在4′，6-二mid 基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液中培養，然后通過熒光顯微鏡（Carl Zeiss，Dublin，CA）進行IF捕獲，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件進行細胞表面積測量。所有實驗至少重復3 遍。

1.9 蛋白質提取和蛋白質印跡 根據制造商的說明，使用RIPA 裂解緩沖液（Beyotime，Shanghai，China）從培養的心肌細胞中提取總蛋白。收集上清液，用Pierce BCA 蛋白質測定試劑盒（Thermo Scientific，Rockford，IL，USA）計算蛋白質濃度。然后，通過10%SDS-PAGE分離等量的蛋白質并轉移至PVDF 膜（Millipore，Bedford，MA，USA）。在室溫下用5%脫脂乳封閉1 h后，將膜用一抗在4℃下免疫染色過夜，在TBST 中洗滌3 次，然后在室溫下與辣根過氧化物酶-標記的二抗（Cell Signaling Technology，Danvers，MA）孵育1 h。用增強的化學發光試劑（Cell Signaling Technology Inc.，USA）檢測條帶信號。通過用GAPDH 抗體探測相同的印跡來標準化蛋白質水平。一抗購自以下來源：anti-ANF、anti-BNP、anti-β-MHC 及anti-GAPDH（Santa Cruz，CA，USA）;使用image J 軟件掃描和量化每個條帶的強度。所有實驗至少重復3 遍。

2 結果

2.1 MIR-138-5p 在壓力負荷和AngⅡ引起的心肌肥大中的表達 建立AngⅡ誘導的原發性心肌肥大和TAC 大鼠模型。結果顯示，與假手術組相比，AB組大鼠的心臟體積以及心臟橫截面積明顯增大（圖1A），且心肌細胞中MIR-138-5p 的mRNA 水平均明顯下降（圖1B，F=21.578，P＜0.001）；相對于Con 組，AngⅡ組細胞表面積明顯增大（圖1C）;且心肌細胞中miR-138-5p 的mRNA 水平均明顯下降（圖1D，F=23.790，P＜0.001）。

圖1 MIR-138-5p 在壓力負荷和AngⅡ引起的心肌肥大中的表達情況Fig 1 The expression of MIR-138-5p in myocardial hypertrophy caused by pressure overload and AngⅡ

2.2 MIR-138-5p 過表達對AngⅡ誘導的的心肌肥大的影響 本實驗通過α-肌動蛋白染色和Western印跡評估了各組心肌細胞的表面積心肌肥大標志蛋白表達情況，結果顯示：與AngⅡ+ miR-NC 組相比，AngⅡ+MIR-138-5p-mimic 組心肌細胞中MIR-138-5p 表達明顯增加（圖2A）。與AngⅡ+MIR-NC組相比，AngⅡ+MIR-138-5p-mimic 組心肌細胞的表面積（圖2B）和心肌肥大標志物表達均明顯下降（圖2D-F，F=9.532、11.199、8.125，均P＜0.01）。

圖2 MIR-138-5p 過表達對AngⅡ誘導的心肌肥大的影響Fig 2 The effect of MIR-138-5p overexpression on Ang Ⅱ-induced cardiac hypertrophy

2.3 MIR-138-5p 與HDAC4 基因的靶點驗證 結果顯示，在WT 組中，miR-mimic 組的HDAC4 相對熒光素酶活性比miR-NC 組顯著降低（圖3A，F=22.578，P＜0.001）；而Mut 組中，兩組的HDAC4 相對熒光素酶活性無統計學意義（圖3A）。Western 印跡結果顯示：與NC 組相比，miR-mimic 組HDAC4 蛋白水平表達顯著下降（圖3B，F=25.530，P＜0.001）。

圖3 MIR-138-5p 與HDAC4 基因的靶點驗證Fig 3 Target validation of MIR-138-5p and HDAC4 genes

2.4 miR-138-5p 通過靶向HDAC4 影響AngII 誘導的心肌肥大 本實驗為了探究MIR-138-5p 抑制AngⅡ誘導的心肌肥大是否與HDAC4 表達有關，于是miR-138-5p 模擬物與HDAC4 共轉化為H9c2細胞系，檢測轉染HDAC4 后miR-138-5p 模擬物H9c2 細胞的表面積及心肌肥大標志物的蛋白水平。結果顯示，與AngⅡ組相比，AngⅡ+miR-138-5p-mimic組心肌細胞表面積明顯減小，且其中心肌肥大標志蛋白表達明顯降低（F=24.634、23.214、23.734，均P＜0.001），見圖4；與AngⅡ+miR-138-5p-mimic 組相比，AngⅡ+miR-138-5p-mimic+pcDNA- HDAC4 組心肌細胞表面積明顯增大，且其中心肌肥大標志蛋白表達明顯升高（F=10.134，P＜0.01），見圖4。

圖4 miR-138-5p 通過靶向HDAC4 影響AngⅡ誘導的心肌肥大Fig 4 miR-138-5p affects AngⅡ-induced cardiac hypertrophy by targeting HDAC4

3 討論

心肌肥大可有效補償心肌的重負荷。然而，心肌細胞持續增大可能導致心臟負擔過重，甚至有致死危險[7-8]。已有研究發現，大量的miRNAs 在心臟肥大中發揮重要作用。例如，miR-142-3p 的過表達通過調節線粒體功能，來改善心臟肥大[9]。然而，miR-138-5p 在心臟肥大中表達如何，發揮何作用及其分子機制尚未文獻報道。

在本研究中，首次發現在壓力TAC 大鼠模型和AngⅡ誘導的心肌肥大模型中，miR-138-5p 的表達明顯下調。有研究發現，miRNA-138-5p 靶向NFIBSnail1 軸以抑制結直腸癌細胞遷移和化學耐藥性[10]，也已證明其可通過靶向survivin 來促進膀胱癌細胞的增殖和侵襲[11]。然而，miRNA-138-5p 在心臟肥大中發揮何作用，尚不清楚。

為了探究miRNA-138-5p 對心臟肥大反應的作用，將miRNA-138-5p-mimic 轉染到AngⅡ處理過的心肌細胞（H9c2），采用α-肌動蛋白染色和蛋白質免疫印跡方法檢測心肌細胞的表面積和心肌肥大標志蛋白的表達情況，結果顯示，相對于AngⅡ+miRNC 組，AngⅡ+miR-138-5p-mimic 組心肌細胞的表面積和心肌肥大標志蛋白，如心鈉素（ANP）、腦鈉肽（BNP）和β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）表達均明顯下降。這些發現表明，心肌細胞中miR-138-5p的過表達可以減弱心臟肥大反應。

接下來，筆者采用TargetScan 在線軟件和熒光素酶測定法，發現miR-138-5p 可以干擾HDAC4 的基因表達，且RT-PCR 結果也證實了HDAC4 是miR-138-5p 的靶基因。

組蛋白脫乙?；福℉DACs）通過使組蛋白乙酰化或脫乙酰基化來控制各種生物過程，從而調節轉錄因子對基因啟動子的可及性[12]。HDAC 分為4類：Ⅰ類HDAC（HDAC1、2、3 和8）、Ⅱ類HDAC（HDAC4、5、6、7、9 和10）、Ⅲ類HDAC（SIRT1-7）和Ⅳ類HDAC（HDAC11）[13]。有研究表明，HDAC4 可在多種組織中廣泛表達，尤其是在腦[14]、心臟和骨骼肌中。在小鼠中，HDAC4 可減輕由神經支配引起的骨骼肌萎縮[15]。本研究已經證實miR-138-5p 可抑制心臟肥大反應，而且HDAC4 是miR-138-5p 的靶基因。但在心臟肥大反應中，miR-138-5p 和HDAC4的關系如何尚不清楚。

因此，在本實驗中，筆者將miR-138-5p 模擬物和HDAC4 共轉化到H9c2 心肌細胞系中，檢測轉染HDAC4 后的miR-138-5p 模擬物H9c2 的表面積和心肌肥大標志蛋白（如ANP、BNP 和β-MHC）水平。結果顯示：相對于AngⅡ組，AngⅡ+ miR-138-5pmimic 組心肌細胞表面積明顯減小，且其中心肌肥大標志蛋白表達明顯降低（圖4，F=24.634、23.214、23.734、均P＜0.001）；相對于AngⅡ+miR-138-5pmimic 組，Ang Ⅱ+miR-138-5p-mimic+pcDNAHDAC4 組心肌細胞表面積明顯增大，且其中心肌肥大標志蛋白表達明顯升高?？傊?，本數據進一步表明HDAC4 是miR-138-5p 的功能靶標，在心臟肥大反應中起重要作用。

綜上所述，miR-138-5p 通過抑制其靶基因HDAC4，抑制心臟肥大反應，為臨床改善心臟肥大提供了實驗基礎。