髓系特異性SOCS3 基因敲除小鼠的構建及應用

紀辰燕，李星晨，陳桂冬，于津浦

（天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院腫瘤分子診斷中心，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市腫瘤免疫與生物治療重點實驗室，天津 300060）

髓系來源抑制細胞（MDSCs）是由不同分化階段的髓系細胞構成的一群異質(zhì)性細胞[1]。MDSCs 可以通過抑制抗腫瘤免疫反應，促進腫瘤的免疫逃逸[2]。同時，MDSCs 可以通過分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等生長因子，促進腫瘤局部血管生成[3]；或通過促進腫瘤細胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），升高腫瘤干細胞（CSCs）的比例等途徑，直接促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[4-5]。根據(jù)表型差異，MDSCs 可分為單核MDSCs（M-MDSCs）、多形核MDSCs（PMN-MDSCs）和早期MDSCs（eMDSCs）。eMDSCs 是一種新發(fā)現(xiàn)的亞群，具有不成熟表型Lin-HLA-DR-CD33+[1]，可分化為M-MDSCs[6]。eMDSCs 已被證實在腎細胞癌、頭頸部癌、黑色素瘤和卵巢癌中存在，但是其免疫抑制功能尚未被證實，目前缺乏針對腫瘤eMDSCs 研究的荷瘤鼠模型[7-8]。前期研究中，筆者在構建的4T1 乳腺癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)一群表型特征為CD11b+Gr-1-F4/80-MHCII-的eMDSCs。與經(jīng)典MDSCs 相比，這群eMDSCs 具有更強的免疫抑制功能，且能轉(zhuǎn)變成經(jīng)典CD11b+Gr-1+MDSCs。且筆者研究發(fā)現(xiàn)，SOCS3 基因表達降低能影響髓系祖細胞的分化，促進eMDSCs 的產(chǎn)生[9-10]。基于上述機制，筆者利用Cre-loxP 系統(tǒng)構建髓系特異性SOCS3 基因敲除小鼠，并對其接種乳腺癌E0771 細胞、肺癌Lewis 細胞、黑色素瘤B16 細胞，構建3 種eMDSCs 高浸潤的荷瘤鼠模型，為研究eMDSCs 促進腫瘤的分子機制和探索針對eMDSCs 的靶向藥物提供了重要的實驗平臺。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 7 只SPF 級SOCS3fl/-雜合子小鼠（4 雄3 雌），6～8 周齡，18～22 g，1 只SPF 級雄性Lyz2-Cre 鼠，7 周齡，20 g，均購于廣州賽業(yè)生物技術有限公司[SCXK（蘇）2020-0006]，兩種小鼠遺傳背景皆為C57BL/6J。SPF 級野生型C57BL/6J 小鼠雌、雄各3 只，6～8 周齡，18～22 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司[（SYXK（京）2019-0010）]。所有引進小鼠飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院實驗動物中心[（SYXK（津）2017-0005）]，按照SPF 級標準飼養(yǎng)，室溫（23±3）℃，12 h 光照/黑暗循環(huán)，自由取食、飲水，動物實驗經(jīng)天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準（AE-2021013），并按照《實驗動物護理與指南》進行。

1.1.2 細胞系 本研究中使用的小鼠乳腺癌E0771細胞株購自中國醫(yī)學科學院，小鼠肺腺癌LLC（Lewis lung cancer）細胞株購自廣州賽庫生物技術有限公司，小鼠黑色素瘤B16（B16 melanoma）細胞株購自ATCC，皆用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養(yǎng)基于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.1.3 實驗材料 快速DNA 提取擴增套裝（天根生化科技有限公司），DNATrziol（Invitrogen 有限公司），RT Response Kit、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa），CD11b Micro Beads、Anti-Gr-1 antibodies、Anti-Biotin MicroBeads（美天旎生物有限公司），紅細胞裂解液（碧云天），GAPDH 抗體、SOCS3 抗體（CST），羊抗鼠IgG 單克隆抗體、羊抗兔IgG 單克隆抗體（中杉金橋），Percp-anti-CD45 抗體、PE-anti-Gr-1 抗體、PE-anti-F4/80 抗體、FITC-anti-CD11b 抗體、FITC BrdU Flow Kit、Apoptosis Detection Kit（BD 有限公司），APC anti-CD3 抗體（Biolegend 公司），Dynabeads?mouse T-Activator CD3/CD8（Gibio，美國），T Cell Isolation Kit（MiltenyiBiotec，美國）；熒光定量PCR儀（AB7500，Applied Biosystems，中國），普通PCR儀（BIO-RAD，美國），化學發(fā)光凝膠成像分析儀（BIO-RAD，美國）。

1.2 方法

1.2.1 SOCS3fl/-小鼠的構建 通過生物信息學分析驗證小鼠基因組中SOCS3 基因的DNA 序列，并根據(jù)該序列構建敲除載體和基因打靶策略。酶切線性化載體，通過電穿孔法將上述線性化載體轉(zhuǎn)入胚胎干細胞（ES 細胞），并通過藥物進行抗藥性篩選。通過PCR 鑒定同源重組ES 細胞克隆，并通過Southern 印跡分析進行確認。通過顯微注射將同源重組ES 細胞移植到囊胚中，后將囊胚移植入代孕母鼠的子宮內(nèi)獲得子代嵌合體小鼠，將其與flp 工具鼠交配，獲得去除抗藥基因的SOCS3fl/-小鼠。

1.2.2 SOCS3fl/-小鼠的鑒定 SOCS3fl/-小鼠基因型鑒定方法如下。區(qū)域一上游引物F1（5′-GAAGATCC CTGATTCCCGTCATACTC-3′）和下游引物R1（5′-ATGGGGAGAGACACAAGAGCCCTA-3′）用于首次PCR 篩選，來自重組等位基因的240 bp 片段代表陽性小鼠。區(qū)域二上游引物F2（5′-CTGGGAAAACAGC CATCTATTCATCC-3′）和下游引物R2（5′-GTTGTTG CGTCTGCCCCAAACT-3′）用于PCR 再次確認，從陽性小鼠中擴增出來自重組等位基因的324 bp 片段。

1.2.3 髓系特異性SOCS3 基因敲除小鼠的繁育SOCS3fl/-小鼠自交，PCR 鑒定F2 代小鼠，篩選出SOCS3fl/fl小鼠。將SOCS3fl/fl小鼠與Lyz2-Cre 工具鼠雜交獲得F3 代SOCS3fl/-LysM-Cre+/-小鼠。F3 代小鼠進行自交，獲取髓系特異性SOCS3 基因敲除小鼠（SOCS3fl/flLysM-Cre+/+小鼠，SOCS3KO鼠）。

1.2.4 髓系特異性SOCS3 基因敲除小鼠的鑒定

1.2.4.1 DNA 提取 取鼠尾至無酶EP 管，將其打碎處理為細胞懸液，10 000 r/min 離心1 min，棄上清后加入200 μL 裂解緩沖液，震蕩至徹底懸浮。加入20 μL蛋白酶K，混勻，56℃1 h，后95℃5 min 滅活蛋白酶K，12 000 r/min 離心5 min，取上清至新的無酶EP 管，4℃冰箱放置備用。

1.2.4.2 PCR 擴增 PCR 體系為20 μL，內(nèi)含模板DNA 1μL，2×PCR Reagent 10 μL，正反向引物各0.5 μL，DEPC 水8 μL。使用PCR 擴增儀循環(huán)擴增，反應條件：預變性94℃，3 min；變性94℃，30 s；退火55℃，30 s，重復40 個循環(huán)；延伸72℃6 min。

1.2.4.3 瓊脂糖電泳 取PCR 擴增后產(chǎn)物8 μL 進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測產(chǎn)物大小。

1.2.4.4 SOCS3KO鼠基因組鑒定 首先對F4 代小鼠進行SOCS3fl/fl小鼠鑒定，然后取上述SOCS3fl/fl小鼠進行Cre 的鑒定，即LysM-Cre+/+小鼠鑒定，最后取SOCS3fl/flLysM-Cre+/+小鼠的髓系細胞進行SOCS3 基因敲除鑒定。SOCS3fl/fl小鼠基因組鑒定結果判斷：上游引物F2 和下游引物R2 用于鑒定SOCS3fl/fl小鼠。PCR 結果判定：（1）只有一個條帶，大小為324 bp，為SOCS3fl/fl小鼠。（2）只有一個條帶，大小為186 bp，為野生型小鼠。（3）兩個條帶，分別為324、186 bp，為SOCS3fl/-小鼠。Cre 基因的鑒定：取F4 代SOCS3fl/fl小鼠進行Cre 基因的鑒定，PCR 結果判定：只有一個條帶，大小為204 bp，為LysM-Cre+/+小鼠。Cre 基因鑒定的上游引物序列為5′-GAACGCACTGATTTCGACCA-3′，下游引物序列為5′-GCTAACC AGCGTTTTCGTTC-3′。最后取SOCS3KO鼠的髓系細胞進行鑒定，PCR 結果判定：（1）只有一個條帶，大小為324 bp，Cre 基因表達不成功。（2）只有一個條帶：520 bp，SOCS3KO鼠。髓系細胞SOCS3 基因鑒定的引物為上游引物F3、上游引物F2 和下游引物R2，F(xiàn)3序列為5′-ACTTCACGGCTGCCAACATCTG-3′。

1.2.5 Western 印跡 使用含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液分離總蛋白。蛋白質(zhì)提取物通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行分離，并濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h，并在SOCS3 抗體稀釋液中4℃孵育過夜。然后在室溫下加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的鼠或兔二抗，室溫孵育1 h，用Chemiluminescent HRP Substrate 顯影液顯影，利用Image J 軟件定量分析SOCS3 蛋白的相對表達量（內(nèi)參為GAPDH）。

1.2.6 流式細胞術 取小鼠骨髓，用70 μm 濾網(wǎng)過濾后裂解紅細胞，再次用70 μm 濾網(wǎng)過濾，PBS 清洗并按5×105個/100 μL 重懸，流式管加100 μL 骨髓細胞懸液備用。腫瘤組織充分研磨后進行過濾，PBS 清洗后按5×105個/100 μL 重懸，流式管加100 μL 腫瘤細胞單細胞懸液備用。在每管中分別加入Percp-anti-CD45 抗體、FITC-anti-CD11b 抗體、PEanti-Gr-1 抗體、PE-anti-MHC II 抗體、PE-anti-F4/80 抗體各2.5 μL，震蕩均勻后室溫孵育20 min，PBS 清洗，流式細胞儀檢測。

1.2.7 Annexin V 檢測T 細胞凋亡 將T 細胞與CD11b+Gr-1-的骨髓細胞、SOCS3KO鼠eMDSCs、腫瘤原位eMDSCs 按照1∶3 比例共培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加CD3/CD8 抗體刺激T 細胞活化。72 h 后收集T 細胞，PBS 清洗，結合緩沖液按2×105個細胞/100 μL重懸，取100 μL 懸液于流式管中備用。加入2.5 μL APC-anti-CD3 抗體，室溫避光孵育20 min，PBS 清洗后用100 μL 結合緩沖液重懸，加入5 μL Annexin V 和5 μL 7-AAD，室溫避光孵育15 min，使用流式細胞儀檢測。

1.2.8 Brdu 檢測T 細胞增殖 將T 細胞與CD11b+Gr-1-髓系細胞、SOCS3KO鼠骨髓中的eMDSCs、腫瘤原位eMDSCs 按照1∶3 比例共培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加CD3/CD8 抗體刺激T 細胞活化。72 h 后收集T 細胞，PBS 清洗，結合緩沖液按2×105個細胞/100 μL重懸，取100 μL 懸液于流式管中備用。加入2.5 μL APC-anti-CD3 抗體，室溫孵育20 min，PBS 清洗。加入100 μL Cytofix/Cytoperm Buffer，4℃避光孵育20 min，Perm/wash buffer 清洗。加入Cytofix/Cytoperm Buffer Plus 100 μL，4℃避光孵育10 min 后，Perm/wash buffer 清洗。加入100 μL Cytofix/Cytoperm Buffer，4℃避光孵育5 min，Perm/wash buffer 清洗。加入Dnase，37℃水浴孵育1 h，Perm/wash buffer清洗。加入稀釋的Brdu 抗體50 μL，室溫避光孵育20 min，Perm/wash buffer 清洗，重懸細胞后上機檢測。

1.2.9 動物實驗 將處于對數(shù)生長期的E0771 細胞按照2×106/（120 μL·只），皮下接種野生型C57BL/6J小鼠（WT 鼠）和SOCS3 敲除小鼠（雌性，6～8 周齡，18～22 g）第4 乳腺脂肪墊上，將LLC 按1×106/（120 μL·只）、B16 按照5×105/（120 μL·只），皮下接種野生型小鼠和SOCS3KO小鼠（雌性，6～8 周齡，18～22 g）腹股溝，每3 d 觀察腫瘤的生長狀況，測量腫瘤長短徑，連續(xù)進行3 周，計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。公式：體積=ab2/2（a 為長徑，b 為短徑）。

2 結果

2.1 SOCS3fl/-小鼠的構建 SOCS3fl/-小鼠構建方式如圖1 所示。將上述小鼠與flp 工具鼠交配，獲得去除抗藥基因的SOCS3fl/-小鼠7 只。

圖1 SOCS3fl/-小鼠構建方式及鑒定位點Fig 1 Construction methods and identification sites of SOCS3fl/-mice

2.2 PCR 鑒定SOCS3fl/-小鼠結果 二步法鑒定SOCS3fl/-小鼠，通過PCR 對區(qū)域一進行鑒定，取上述鑒定結果為陽性的小鼠，對其區(qū)域二再次鑒定，最終獲得SOCS3fl/-小鼠。如圖2 所示，F(xiàn)1 代SOCS3fl/-小鼠區(qū)域一的擴增產(chǎn)物為240 bp 和166 bp 兩條DNA片段，區(qū)域二的擴增產(chǎn)物為324 bp 和186 bp 兩條DNA 片段，與預期結果一致，而WT 小鼠區(qū)域一的擴增產(chǎn)物為一條166 bp 的DNA 片段，區(qū)域二的擴增產(chǎn)物為一條186 bp 的DNA 片段。

圖2 SOCS3fl/-小鼠DNA PCR 鑒定Fig 2 Results of genotype identification in SOCS3fl/-mice by PCR

2.3 髓系特異性SOCS3 基因敲除小鼠的繁育 髓系特異性SOCS3 基因敲除小鼠的繁育方式如圖3 所示。將SOCS3fl/-小鼠自交，取獲得的子代小鼠進行PCR 鑒定，篩選出SOCS3fl/fl小鼠。將SOCS3fl/fl小鼠與Lyz2-Cre 工具鼠雜交獲得F3 代SOCS3fl/-LysM-Cre+/-小鼠。將F3 代小鼠進行自交獲取髓系特異性SOCS3基因敲除小鼠（SOCS3fl/flLysM-Cre+/+小鼠，SOCS3KO鼠）。

圖3 髓系特異性SOCS3 基因敲除小鼠的構建Fig 3 Construction of myeloid-specific SOCS3 gene knockout mice

2.4 SOCS3KO小鼠的鑒定結果 SOCS3KO小鼠為攜帶Cre 基因的SOCS3fl/fl小鼠，其基因型為SOCS3fl/flLysM-Cre+/+。取F4 代小鼠鼠尾進行PCR 鑒定，其中SOCS3fl/fl小鼠擴增產(chǎn)物為一條324 bp 的DNA 片段，對上述SOCS3fl/fl小鼠的Cre 基因進行進一步鑒定，擴增產(chǎn)物為一條204 bp DNA 片段的小鼠即為SOCS3KO小鼠，見圖4A、4B。SOCS3KO小鼠的SOCS3基因在髓系細胞中被特異性敲除，其基因型如圖4C所示。通過PCR 對F4 代SOCS3KO小鼠的髓系細胞進行了鑒定，與預期一致，擴增產(chǎn)物出現(xiàn)一條520 bp的DNA 片段，見圖4D。結果顯示，與Cre 工具鼠相比，SOCS3KO小鼠髓系細胞中SOCS3 蛋白表達顯著降低，而腸組織、皮膚和肝臟中SOCS3 蛋白表達無顯著變化，見圖4E。

圖4 SOCS3KO 小鼠鑒定Fig 4 Identification of SOCS3KO mice

2.5 髓系SOCS3 基因的敲除促進eMDSCs的生成和免疫抑制活性 如圖5A 所示，在敲除SOCS3 基因后，小鼠骨髓中表型為CD11b+Gr-1-F4/80-MHCII-的eMDSCs 比例顯著升高[（10.54±0.50）%vs.（40.5±2.85）%，t=17.94，P＜0.001]。與CD11b+Gr-1+細胞相比，腫瘤原位eMDSCs（t-eMDSCs）可顯著抑制T 細胞增殖[（18.80±0.76）% vs.（9.54±0.67）%，t=15.95，P＜0.001）]，促進T 細胞凋亡[（8.33±0.75）% vs.（18.69±0.61）%，t=18.48，P＜0.001）]。SOCS3KO小鼠骨髓中分選的eMDSCs 免疫抑制活性與腫瘤原位eMDSCs 相似，也可顯著抑制T 細胞增殖[（18.80±0.76）%vs.（9.95±0.77）%，t=14.21，P＜0.001]，促進T細胞凋亡[（8.33±0.75）% vs.（16.9±0.79）%，t=13.53，P＜0.001]，見圖5B、5C。

圖5 特異性SOCS3 基因敲除對eMDSCs 的生成和免疫抑制功能的影響Fig 5 Effects of specific SOCS3 gene knockout on the production and immunosuppressive function of eMDSCs

2.6 髓系SOCS3 基因的敲除促進腫瘤生長和eMDSCs 的浸潤 為構建eMDSCs 高浸潤的荷瘤鼠模型，分別將B16、E0771 與LLC 細胞接種到WT 小鼠和SOCS3KO小鼠皮下。結果顯示，SOCS3KO組的黑色素瘤[（931.40±145.50）mm3vs.（293.60±96.16）mm3，t=6.90，P＜0.001]、乳腺癌[（377.9±36.12）mm3vs.（139.60±20.42）mm3，t=12.84，P＜0.001]、肺癌[（512.40±82.58）mm3vs.（240.20±28.14）mm3，t=6.98，P＜0.001]體積顯著高于WT 組，見圖6A、6B、6C。且流式結果表明，與WT組相比，SOCS3KO組黑色素瘤[（51.40±2.40）% vs.（88.80±1.20）%，t=24.14，P＜0.001]、乳腺癌[（19.10±0.90）% vs.（38.8±1.06）%，t=24.56，P ＜0.001]、肺 癌[（27.55±2.03）% vs.（46.90±0.95）%，t=14.93，P＜0.001]中的eMDSCs 比例顯著升高，見圖6D、6E、6F。

圖6 髓系SOCS3 基因敲除對腫瘤生長和eMDSCs 浸潤的影響Fig 6 Effect of SOCS3 gene knock-out on tumor growth and infiltration of eMDSCs

3 討論

具有促腫瘤作用的MDSCs 最早發(fā)現(xiàn)于荷瘤鼠，后在腫瘤患者體內(nèi)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[11]。同時Lang 等[12]分析實體瘤患者外周血中MDSCs 的比例與患者總生存率的關系時發(fā)現(xiàn)，MDSCs 比例的增高降低了患者的總生存率，至此MDSCs 成為腫瘤研究的又一焦點。研究證實腫瘤組織中的MDSCs 促進了肺癌和結腸癌的遠處轉(zhuǎn)移[13-14]。臨床試驗，證實針對MDSCs的靶向治療能抑制腫瘤生長，延長患者的生存期[15]，且抑制MDSCs 可以提高免疫檢查點抑制劑的療效[16-17]。總之，MDSCs 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。

MDSCs 由髓系祖細胞分化發(fā)育而來。正常情況下，髓系祖細胞可分化成為單核細胞、中性粒細胞、巨噬細胞，而在腫瘤患者體內(nèi)，髓系祖細胞受到腫瘤細胞分泌的可溶性因子的調(diào)控，出現(xiàn)分化障礙，成為具有免疫抑制能力的MDSCs[18]。目前研究MDSCs時對其的獲取主要包括3 個途徑，一是直接從荷瘤小鼠的脾臟或腫瘤組織中分離MDSCs，二是通過白細胞介素-6（IL-6）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）等細胞因子誘導髓系細胞增殖分化成MDSCs，三是直接建立MDSCs 干細胞系。上述方法各有其局限性，利用流式分選或磁珠分選從荷瘤鼠脾或腫瘤組織中獲得的MDSCs 雖然得到純化，但數(shù)量很少；而腫瘤細胞在體外培養(yǎng)或體內(nèi)接種過程中會出現(xiàn)優(yōu)勢生長，干擾實驗結果；體外誘導法存在MDSCs 分化效率低的問題[19-20]。因此，MDSCs 相關研究受到現(xiàn)有方法的限制。

本研究發(fā)現(xiàn)MDSCs 的亞群eMDSCs 的生成受腫瘤源性IL-6 影響。正常生理狀況下，IL-6 引起一過性Janus 激酶/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK/STAT3）通路激活，但腫瘤源性IL-6 可誘導髓系細胞中SOCS3 的缺失，導致JAK/STAT3 通路持續(xù)激活，從而促進了eMDSCs 的生成和擴增[9-10]。本研究利用Cre-loxP 系統(tǒng)成功構建了髓系特異性SOCS3基因敲除小鼠，對其進行基因型鑒定和蛋白水平上的敲除效果驗證，確認SOCS3 基因在髓系細胞中特異性敲除。流式細胞學技術比較髓系特異性SOCS3基因敲除小鼠與野生型小鼠骨髓中eMDSCs 數(shù)量的結果顯示，前者eMDSCs 數(shù)量顯著升高，可達到髓系細胞的40%，且該群eMDSCs 具有與腫瘤原位eMDSCs 相似的免疫抑制功能，無腫瘤細胞污染，使得直接從小鼠骨髓中分離eMDSCs 的新獲取方法成為可能。同時，本研究將乳腺癌細胞E0771、肺癌細胞LLC、黑色素瘤細胞B16 接種到髓系特異性SOCS3 基因敲除小鼠皮下，通過流式細胞學技術比較髓系特異性SOCS3 基因敲除小鼠與野生型小鼠所形成的3 種不同瘤子中eMDSCs 比例，結果顯示前者顯著高于后者，證實3 種eMDSCs 高浸潤的荷瘤鼠模型構建成功。

綜上所述，本研究以特異性敲除小鼠髓系細胞中SOCS3 基因的方式，模擬腫瘤源性IL-6 對髓系細胞的調(diào)控作用，促進骨髓中的eMDSCs 的生成和擴增，為MDSCs 的獲取提供了新的有效方法，為eMDSCs相關實驗研究提供了穩(wěn)定的細胞來源。且本研究在髓系特異性SOCS3 基因敲除小鼠的基礎上首次構建了3 種eMDSCs 高浸潤的荷瘤鼠模型，可以模擬臨床上高eMDSCs 的腫瘤患者，為體內(nèi)探索eMDSCs的促腫瘤機制，尋找新型靶向藥物提供了有力的動物模型。