外源性IL-6 通過STAT3 通路促進卵巢癌細胞對順鉑耐藥

沈洋洋，牛秀瓏，郁春艷，鄭小燕，劉俊汝，鄧為民

（1.天津醫科大學基礎醫學院免疫學系，國家教育部免疫微環境與疾病重點實驗室，天津 300070；2.中國人民武裝警察部隊特色醫學中心勤務環境皮膚疾病防治研究所，天津 300162）

卵巢癌（ovarian cancer，OvCa）是婦科惡性腫瘤中最常見的死因之一，是全球女性第七位常見癌癥，同時死亡率也較高，5 年生存率低于50%[1-2]?；熓悄[瘤治療的重要手段之一，然而耐藥嚴重阻礙了腫瘤化療效果。順鉑是目前用于治療OvCa 最有效的化療藥物之一，但患者經常會出現對順鉑治療的耐藥，因此了解OvCa 對順鉑耐藥機制對腫瘤治療具有重要意義。近年來，越來越多的研究關注腫瘤與炎癥之間的聯系。白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）是由多種細胞產生的炎癥因子，研究發現，IL-6 與OvCa 之間關系密切，涉及腫瘤的生存、生長、侵襲、血管生成和耐藥[3-4]。臨床研究顯示，IL-6水平與腫瘤的不良預后和化療敏感性相關，IL-6 和OvCa 的惡性程度以及預后相關[5-6]，IL-6 可以促進OvCa 干細胞聚集[7]，可通過核因子（NF）-κB 途徑促進OvCa 耐藥[8]等。本研究對外源性IL-6 在誘導OvCa 順鉑耐藥中的作用進行了初步研究，為臨床解決OvCa 順鉑耐藥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 裸鼠購自中國北京軍事醫學科學院實驗動物中心；人OvCa 細胞系A2780 細胞購自美國ATCC 公司；胎牛血清（FBS）購自美國GIBCO 公司；RPMI-1640 培養基購自中國南京凱基生物科技發展有限公司；重組人白細胞介素-6（recombinant human interleukin 6，rhIL-6）、AG490（JAK2/STAT3 抑制劑）購自美國Sigma 公司；STAT3 抗體購自美國SAB Biotech 公司；p-STAT3 抗體購自美國Cell Signaling 公司；β-actin 購自中國北京瑞康生物技術有限公司；順鉑購自中國齊魯醫藥公司；HRP 酶標二抗購自美國Rockland 公司；Annexin V-FITC 凋亡試劑盒購自中國南京凱基生物科技發展有限公司；CCK8 試劑盒購自中國碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 A2780 細胞用含有10%FBS 的RPMI-1640 培養基培養，培養基中含80 U/mL 青霉素和80 μg/mL 鏈霉素，置于5%CO2、37℃培養箱中培養，每1～2 d 更換培養基并消化傳代。

1.2.2 CCK8 實驗 取對數生長期A2780 細胞接種于96 孔板，每孔為3×103/100 μL，分為對照（Control）組、AG490 組、順鉑（Cisplatin）組、AG490+Cisplatin組、重組人白細胞介素-6（rhIL-6）組、rhIL-6+AG490 組、rhIL-6+Cisplatin 組和rhIL-6+AG490+Cisplatin 組，共8 組，每組設立3 個復孔。待細胞貼壁后，AG490 組、AG490+Cisplatin 組、rhIL-6+AG490組和rhIL-6+AG490+Cisplatin 組加入AG490（50 μmol）[9]預處理1 h，之后加入rhIL-6（50 ng/mL）[10]或順鉑（10 μmol），5%CO2、37°C 培養箱中培養72 h，培養結束后去除培養基，用Hank′s 洗滌兩次，每孔加入100 μL 培養基（含10 μL 的CCK8 試劑），酶標儀檢測波長為450 nm 的光密度值（OD450），利用SPSS 對數據進行統計學分析。

1.2.3 Western 印跡實驗 取對數生長期A2780 細胞接種于6 孔板，每孔為5×105/2 mL，分為Control 組、AG490 組、rhIL-6 組和rhIL-6+AG490 組。細胞貼壁后加藥處理12 h，將RIPA、蛋白酶抑制劑、磷酸蛋白酶抑制劑以100∶1∶1 配置裂解液，提取細胞總蛋白。BCA 蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度，配置10%的分離膠，將40 μg/孔的蛋白用10%SDS-PAGE 進行電泳分離。電泳后將蛋白轉印于PVDF 膜，100 V 轉膜1 h，用3%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉2 h 后，加入特異性一抗，4℃孵育過夜，TBST 漂洗3 次，每次10 min，加入HRP 標記的二抗室溫孵育2 h。TBST清洗后化學發光底物檢測試劑盒進行檢測。將目的蛋白與內參的灰度比值作為蛋白的相對表達豐度。

1.2.4 細胞凋亡實驗 取對數生長期A2780 細胞接種于12 孔板，每孔為1×105/mL，分為Control 組、AG490 組、Cisplatin 組、AG490+Cisplatin 組、rhIL-6組、rhIL-6+AG490 組、rhIL-6+Cisplatin 組和rhIL-6+AG490+Cisplatin 組，共8 組，同時設立空白管組和單染管組。細胞貼壁后AG490 組、AG490+Cisplatin 組、rhIL-6+AG490 組和rhIL-6+AG490+Cis platin 組加入AG490（50 μmol）預處理1 h 之后按實驗方案各組加入rhIL-6（50 ng/mL）或順鉑（10 μmol），5%CO2、37℃培養箱中培養48 h。培養結束后用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集細胞，加入0.1%BSA-PBS 洗滌2 次。棄去上清，每管加入500 μL 試劑盒中的Binding Buffer 重懸細胞，混勻。加入5 μL的AnnexinV 溶液混勻，再加入5 μL 的碘化丙啶（PI）溶液，混勻。避光室溫孵育10 min。細胞通過400 目篩網過濾成單細胞懸液備檢。用流式細胞儀進行檢測，用空白管和單染管調節電壓和熒光補償，Annexin V-FITC 綠色熒光通過FITC 通道（FL1）檢測，PI 紅色熒光通過PI 通道（FL2）檢測，利用FlowJo 軟件進行數據分析。

1.2.5 小鼠體內實驗 將36 只8 周齡雌性裸鼠隨機分為Control 組、rhIL-6 組、Cisplatin 組、AG490組、rhIL-6+Cisplatin 組和rhIL-6+AG490+Cisplatin組，共6 組，每組6 只。腹腔注射A2780 細胞（5×106/200 μL/鼠），按照不同分組腹腔注射rhIL-6、AG490和順鉑，其中第1 天開始注射rhIL-6[1 μg/（kg·周）]，第1 天開始注射AG490[5 mg/（kg·d）]，從第4 天開始注射順鉑 [4 mg/（kg·周）]，Control 組腹腔注射PBS。4 周后頸椎脫臼處死小鼠，打開腹腔，觀察瘤結節生成情況并拍照，計數瘤結節、稱重。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0 軟件進行統計學分析，其中符合正態分布數據以±s 表示。多組間相互比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組OvCa 細胞增殖情況 由圖1 可知，與Control 組相比，rhIL-6 組細胞增殖增加[（1.330±0.024）vs.（1.264±0.012），t=4.148，P＜0.05]，Cisplatin組細胞增殖降低[（1.199±0.005）vs.（1.264±0.012），t=8.050，P＜0.01]，AG490 組細胞增殖無變化[（1.283±0.024）vs.（1.264±0.012），t=1.201，P＞0.05]。與Cisplatin 組相比，rhIL-6+Cisplatin 組細胞增殖增加[（1.314±0.022）vs.（1.199±0.005），t=8.439，P ＜0.01]。與rhIL-6+Cisplatin 組相比，rhIL-6+Cisplatin+AG490 組細胞增殖降低[（1.242±0.011）vs.（1.314±0.022），t=4.860，P＜0.01]。

圖1 各組細胞增殖的情況Fig 1 Result of cell proliferation in each group

2.2 各組p-STAT3 蛋白表達情況 由圖2B 可見，與Control 組相比，rhIL-6 組p-STAT3 蛋白表達明顯增加[（2.27±0.46）vs.（1.0±0），t=6.55，P＜0.01]。與rhIL-6 組相比，rhIL-6+AG490 組的p-STAT3 蛋白明顯降低[（0.99±0.12）vs.（2.27±0.46），t=6.34，P＜0.01]。

2.3 各組細胞凋亡情況 由圖3B 可知，與Control組相比，Cisplatin 組細胞凋亡顯著增加 [（12.70±0.36）vs.（2.75±0.38），t=32.56，P＜0.001]。rhIL-6 組與Control 組 對 比 沒 有 統 計 學 差 別[（3.49±0.40）vs.（2.75±0.38），t=2.272，P＞0.05]。與Cisplatin 組相比，rhIL-6+Cisplatin 組細胞凋亡顯著降低[（7.75±0.23）vs.（12.70±0.36），t=20.03，P＜0.001]。與rhIL-6+Cisplatin 組相比，rhIL-6+Cisplatin+AG490 組細胞凋亡顯著增加[（13.36±0.37）vs.（7.75±0.23），t=22.16，P＜0.001]。與AG490+Cisplatin 組相比，rhIL-6+Cisplatin+AG490 組細胞凋亡差異無統計學意義[（12.88±0.87）vs.（13.36±0.37），t=0.8836，P>0.05]。2.4 各組瘤結節重量和大小情況 由圖4B 可知，與Cisplatin 組相比，rhIL-6+Cisplatin 組小鼠的瘤結節數量（圖4A）和重量（圖4B）明顯增加[（0.206±0.072）vs.（0.107±0.022），t=2.783，P＜0.05]。與rhIL-6+Cisplatin 組相比，rhIL-6+Cisplatin+AG490 組瘤結節數量和重量均顯著降低[（0.065±0.035）vs.（0.206±0.072），t=3.306，P＜0.05]。

3 討論

OvCa 是困擾女性的三大生殖系統惡性腫瘤之一，且死亡率高居不下。順鉑是OvCa 主要的化療藥物，然而化療耐藥使腫瘤預后較差，耐藥性是阻礙成功抗癌治療的最棘手障礙之一，因此迫切需要解決耐藥的問題。本實驗通過體內體外兩方面的實驗，證實IL-6 可以通過STAT3 信號通路促進OvCa對順鉑耐藥。

IL-6 是一種多功能促炎性因子，在與其膜結合受體（IL-6R）結合后激活經典的信號通路。IL-6 過表達和多種腫瘤相關，包括結直腸癌、OvCa、乳腺癌等[11]，與OvCa 的發生、發展、預后等密切相關。臨床資料顯示，OvCa 患者高表達IL-6，IL-6 水平升高與不良預后和化療敏感性差相關，IL-6 可以誘導OvCa 細胞多藥耐藥基因的表達，內源性或外源性IL-6 誘導A2780 細胞中多藥耐藥蛋白表達升高，且與IL-6 呈正相關[12]，靶向IL-6 治療已經被認為是一種可行的治療手段。IL-6 調控下游多種信號通路，在腫瘤細胞對化療耐藥起著重要作用[11]，其中研究最多的是IL-6/JAK2/STAT3 軸[13]。

IL-6/JAK2/STAT3 軸在許多類型的癌癥中均異常激活，而這種過度激活通常與不良的臨床預后相關。在腫瘤微環境中，IL-6/JAK2/STAT3 信號轉導可驅動腫瘤細胞的增殖、耐藥、侵襲性和遷移，同時強烈抑制抗腫瘤免疫反應[14]。人OvCa 細胞系A2780不分泌IL-6 且對順鉑敏感[8]，因此本研究選擇A2780 作為觀察IL-6 影響OvCa 發生順鉑耐藥機制的研究對象。CCK8 實驗結果顯示單獨rhIL-6 可促進A2780 的增殖，順鉑聯用rhIL-6 可以降低前者對A2780 增殖的抑制作用，而AG490 可以抑制rhIL-6 的作用，說明外源性IL-6 通過影響STAT3 通路促進A2780 增殖。細胞凋亡實驗結果顯示，與Cisplatin 組相比，聯用rhIL-6 能促進A2780 對順鉑耐藥，而這個作用被AG490 所抑制，同時與AG490+Cisplatin 組相比，增加rhIL-6 處理并無顯著性差異，說明rhIL-6 通過STAT3 通路誘導OvCa 對順鉑耐藥。此外Western 印跡結果表明，IL-6 可以顯著促進p-STAT3 的表達，說明外源性IL-6 可以通過誘導STAT3 磷酸化來促進OvCa 抗凋亡和對順鉑耐藥。和體外實驗結果相同，小鼠體內實驗結果顯示，與Cisplatin 組相比，rhIL-6+Cisplatin 組小鼠瘤結節數量和重量明顯增加，而再聯用AG490會抑制rhIL-6 的作用，說明rhIL-6 通過STAT3 信號通路體內誘導OvCa 對順鉑耐藥。IL-6/JAK2/STAT3 通路促進OvCa 對順鉑耐藥的具體機制較為復雜，涉及多個方面，IL-6/JAK2/STAT3 軸在干細胞干性、誘導耐藥蛋白、缺氧、上皮間質表型轉化、促進抗凋亡蛋白表達和DNA 修復相關基因表達等多方面促進腫瘤耐藥[15-20]。

綜上所述，本研究從體內、體外兩個方面證明外源性IL-6 可以通過STAT3 通路誘導OvCa 對順鉑耐藥，為臨床OvCa 患者治療中炎癥誘導耐藥的處理提供新的思路和策略。