基于網絡藥理學探討托法替布聯合甲氨蝶呤治療類風濕關節炎的作用機制

趙妍，趙晶晶，劉愛芬，郭雪梅，康莉，陳兵

（1.天津醫科大學第二醫院內分泌科，天津 300211；2.天津醫科大學第二醫院腎內科，天津 300211；3.天津醫科大學第二醫院麻醉科，天津 300211；4.天津醫科大學圖書館，天津 300070；5.天津醫科大學第二醫院重癥醫學科，天津 300211）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫疾病。它的病理生理機制主要為關節滑膜內的炎癥因子刺激免疫細胞釋放大量炎性和細胞因子，導致關節破壞和關節外血管炎等損害[1]。RA 病程長，病死率高，嚴重影響患者身心健康和生活質量[2-3]。目前，甲氨蝶呤已成為治療RA 的基礎用藥，其化學結構與葉酸相似。其通過抑制二氫葉酸還原酶和酰基轉移酶的活性，抑制嘌呤和嘧啶核苷酸的合成，抑制淋巴細胞活化，減輕炎癥和關節疼痛。但長時間大劑量的應用會增加藥物不良反應，限制了其臨床的廣泛應用[4]。

托法替布是一種小分子Janus 激酶（JAK）抑制劑，實驗證實其通過抑制JAK-信號轉導與轉錄激活因子（STAT）信號通路，降低STAT 的磷酸化水平，從而降低下游炎性細胞因子的合成，達到調控炎癥的目的[5-7]，從而引起了人們的廣泛關注。研究報道，托法替布不但可以明顯緩解RA 患者的癥狀，而且聯用甲氨蝶呤可達到更優的治療效果[8-9]。

目前，托法替布聯用甲氨蝶呤治療RA 的分子機制尚未完全闡明。本文采用網絡藥理學方法，針對托法替布和甲氨蝶呤的預測藥效團、靶蛋白/基因和分子藥理機制進行深入探討，從而確定兩者的適應證和不良反應，更好的指導臨床實踐。

1 材料和方法

1.1 相關數據庫和平臺 化學模組pubchem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、藥效團匹配與潛在識別靶標PharmMapper 在線平臺（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）、STRING 平臺（https://string-db.org）及網絡圖像化軟件Cytoscape（v 3.7.2）。

1.2 化合物結構的篩選和藥效團模型靶點的預測 以“Tofacitinib”和“Methotrexate”為關鍵詞，通過pubchem 數據庫獲取化合物的活性成分，并下載它們的2D 和3D 結構。PharmMapper 平臺上導入化合物的3D 結構文件，得到預測藥效團模型的元素（蛋白結構、特征數目、分值、校正分值、靶點基因等）和可能靶蛋白/基因。

1.3 蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建和可視化分析 利用STRING 平臺獲得靶蛋白/基因之間的關系，構建蛋白質相互作用網絡。將托法替布和甲氨蝶呤的靶蛋白/基因導入網絡圖像化軟件Cytoscape（v 3.7.2），其中“節點（node）”代表靶蛋白/基因，“線（edge）”代表靶點之間的關系，對其網絡特征進行可視化分析。

1.4 富集通路分析 通過統計R 軟件（R x64 3.5.2）對上述靶點進行功能富集分析和信號通路分析。同一種顏色的節點代表同一類型的信號通路，節點的大小代表信號通路的顯著程度。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 托法替布和甲氨蝶呤的化合物結構篩選和藥效團模型靶點預測 通過pubchem 平臺分析得到托法替布和甲氨蝶呤化合物的活性成分和其2D 和3D 結構（圖1）。利用PharmMapper 數據庫得到托法替布預測藥效團模型的特征元素：如表1A 所示，托法替布預測藥效團模型的主要蛋白結構分別為2ecd_A_cavity_2、2qq5_A_cavity_2、2cfv_A_cavity_2等，其支持靶點蛋白的特征數目均大于3，校正分值均大于0.8，靶點基因分別為ABL2、DHRS1、PTPRJ等；如表1B 所示，甲氨蝶呤藥效團模型的主要蛋白結 構 分 別 為 3cki_B_cavity_3、1hi5_A_cavity_1、1n46_B_cavity_1 等，其支持靶點蛋白的特征數目均大于4，校正分值均大于0.6，靶點基因分別為ADAM17、RNASE2、THRB 等。最終鑒定出托法替布71 個和甲氨蝶呤66 個潛在的靶蛋白/基因，且兩種藥物的所有蛋白/基因均用于進一步研究。

表1 托法替布和甲氨蝶呤的預測藥效團模型的主要特征因素Tab1 The main characteristic factors of predictivepharmacophore models of tofacitinib and methotrexate

圖1 托法替布和甲氨蝶呤活性化合物的結構Fig 1 The structures of active compounds of tofacitinib and methotrexate

2.2 PPI 網絡構建和可視化網絡分析 將托法替布和甲氨蝶呤的所有預測靶蛋白/基因導入STRING數據庫，構建共同靶點之間的相互作用關系圖。如圖2A 所示，在過濾值為0.96 條件下，得到托法替布和甲氨蝶呤共有206 對預測靶蛋白/基因。兩者的主要預測靶蛋白/基因為JAK2、JAK3、STAT1、蛋白激酶B（AKT）1、白細胞介素（IL）-2、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）1、MAPK8、表皮生長因子受體（EGFR）等，靶蛋白/基因之間多通過融合（紅色連線）、鄰接（綠色連線）、同現（藍色連線）等進行相互作用。進而采用Cytoscape（v 3.7.2）軟件，將兩種藥物之間的相互調控關系進行網絡可視化。如圖2B 所示，此網絡共有105 個預測靶蛋白/基因和349 條連線，其交互關系與圖2A 一致。

圖2 托法替布和甲氨蝶呤的預測靶點PPI 網絡及網絡可視化Fig 2 PPI network and network visualization for the predictive targets of tofacitinib and methotrexate

2.3 GO 功能富集分析 為進一步研究托法替布和甲氨蝶呤的可能作用機制，采用R x64 3.5.2 軟件進行了GO 功能富集分析，并將結果繪制成氣泡圖。如圖3A 所示，托法替布和甲氨蝶呤的預測靶蛋白/基因在影響受損DNA 結合、ATP 酶結合、核受體活性、轉錄因子活性、直接配體調控序列特異性DNA結合、類固醇激素受體活性、生長因子受體結合和內肽酶活性等功能處顯著富集（均P＜0.05）。且據圖3B 所示，托法替布和甲氨蝶呤的預測靶蛋白/基因在影響ATP 酶結合（P=0.002）、受損DNA 結合（P=0.002）、核受體活性（P=0.002）、轉錄因子活性、直接配體調控序列特異性DNA 結合（P=0.002）功能上富集最顯著，而在影響類固醇激素受體活性（P=0.004）、生長因子受體結合（P=0.022）、內肽酶活性（P=0.029）方面次之。提示托法替布和甲氨蝶呤可能通過調控以上多種生物功能治療RA。

圖3 托法替布和甲氨蝶呤的預測靶點的GO 功能富集分析Fig 3 GO enrichment analysis of the predictive targets of tofacitinib and methotrexate

2.4 KEGG 通路富集分析 對托法替布和甲氨蝶呤的可能循壞通路進行KEGG 分析，如圖4A~C 所示，HER2/neu、E2F、Rac、JNK、Ral、血管內皮生長因子（VEGF）、基質金屬蛋白酶（MMP）s、HBEGF、ERBB2、HER2、Notch、雌激素受體（ER）等可能是托法替布和甲氨蝶呤的預測靶蛋白/基因，JAK-STAT 信號通路、轉化生長因子（TGF）-β 信號通路、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT 信號通路、p53 信號通路、Ras 信號通路、MAPK 信號通路、血管內皮生長因子信號通路、核因子（NF）-κB 信號通路、Notch 信號通路和癌癥通路等信號通路主要參與了托法替布和甲氨蝶呤共同作用的通路循壞。

圖4 托法替布和甲氨蝶呤治療多種疾病的KEGG 通路循環圖Fig 4 KEGG pathway circulation diagram of tofacitinib and methotrexate in the treatment of various diseases

3 討論

RA 是一種由大量的炎癥細胞浸潤、形成血管翳和滑膜炎、并侵犯鄰近關節軟骨導致骨破壞的自身免疫性疾病[10-11]。甲氨蝶呤一直是臨床治療RA 的常規用藥，但對重癥和甲氨蝶呤耐藥的RA 患者療效欠佳。近來臨床研究發現，新研制的藥物托法替布優于甲氨蝶呤或安慰劑，且托法替布聯合甲氨蝶呤對RA 患者表現出更好的治療效果[8，12]。托法替布作為一種處于Ⅲ期臨床試驗的新藥，通過采用網絡藥理學的方法對其進行系統和詳盡的研究，探討其靶基因及相互作用，有助于更好地確定藥物適應證和不良反應。本研究打破單一藥理學研究的局限性，全面地研究并闡述了托法替布聯用甲氨蝶呤的作用機制。

本研究通過pubchem 和PharmMapper 數據庫分別獲取了托法替布和甲氨蝶呤相關化合物的有效成分，并最終鑒定出137 個潛在靶蛋白/基因。其中 包 括 JAK2、JAK3、STAT1、AKT1、IL2、MAPK1、MAPK8、EGFR 等。最后通過GO 功能富集和KEGG 通路分析證實托法替布聯合甲氨蝶呤治療RA 的機制主要與JAK-STAT、TGF-β、PI3K-AKT、p53、Ras、MAPK、VEGF、NF-κB 及Notch 等信號通路密切相關。托法替布作為JAK 特異性抑制劑[13]，是由4 個非受體酪氨酸激酶（JAK1、JAK2、JAK3 和酪氨酸激酶2）組成，對應不同的細胞因子受體。非受體酪氨酸激酶與細胞因子受體結合后可抑制受體相關的JAK，阻礙下游的STATs 被JAK 磷酸化，導致受體無法解離并轉移到細胞核調節基因轉錄，從而影響JAK-STAT 信號通路[14]。托法替布不僅減少了致RA 發病的關鍵基因（基質金屬蛋白酶1 等）的表達，而且減少滑膜STAT1 和STAT3 的磷酸化水平，對RA 具有較好的治療效果[15]。而且STAT 靶基因與NF-κB 信號通路靶基因高度相關，后者則是另一個促炎的關鍵信號通路。腫瘤癌變過程中，特別是微環境中腫瘤細胞和免疫細胞的相互作用時，STAT 信號往往是上調的，其上調涉及的生物過程包括分化、增殖、血管生成和細胞凋亡等。托法替布則通過干擾DNA 轉錄，從而對自身免疫性疾病RA 和腫瘤的相關炎性細胞的活性起到負性調控作用[16-17]。本研究結果亦證實，JAK2、JAK3、STAT1等是托法替布和甲氨蝶呤共同作用的靶蛋白/基因，其參與的JAK-STAT 信號通路與治療RA 的過程密切相關。此外，托法替布可以通過抑制JAK-STAT 信號通路，影響DNA 的表達，從而治療RA[18-19]，與本研究結果一致。目前JAK-STAT 是RA 致病的最重要的信號通路，是本研究網絡中最重要的節點，其上下游因子亦是未來需要重點研究的目標。

炎癥因子是RA 發病和進展的關鍵功能分子[20]。既往研究發現，IL-2 是參與RA 發生、發展的重要炎癥因子，主要與MAPK 蛋白家族具有一定的關聯性。IL-2 與活化T 細胞上的IL-2R 特異性結合后，進而激活具有GTP 酶活性的小蛋白Ras，Ras 進一步激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的Raf 蛋白，最終啟動p42/p44MAPK，其通過以上過程促進T 細胞增殖，并引發炎癥因子大量釋放，造成免疫功能紊亂[21-22]。本研究亦證實IL-2、MAPK 是托法替布和甲氨蝶呤的主要靶蛋白/基因，且MAPK 信號通路在其間發揮著重要的作用。此外，胡志平等[23]研究證實通過抑制PI3K-AKT 通路可以減輕RA 大鼠的炎癥。Harris 等[24]和Smith 等[25]發現PI3K-AKT 信號通路廣泛存在于RA 的滑膜細胞中，且處于異常激活狀態，是造成滑膜細胞失衡凋亡的原因之一。當應用PI3K 抑制劑ZSTK474 后，能明顯改善膠原誘導的小鼠關節炎癥狀，證實其具有較好的抗RA 作用[26]。洪宏海等[27]還發現p53 具有抗RA 的免疫炎癥作用。這些通路多與炎性免疫反應過程有關，本研究中亦體現了以上通路。

VEGF 是RA 病理性血管生成的重要參與者，促使血管翳形成，引起骨破壞[28]。雌激素可調控基質金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3，MMP3），促使成骨細胞膜表面的凋亡基因FasL 斷裂成為可溶性FasL，誘導破骨細胞凋亡，減少骨破壞[29]。與本研究結果相符。本研究亦發現AKT1 與自噬性死亡相關[5]，EGFR 抑制劑能夠誘導自噬[30]，重組人顆粒體蛋白前體通過MAPK 通路調控自噬[31]，STAT3 影響自噬相關基因的轉錄[32]，由此提示托法替布聯合甲氨蝶呤可能通過抑制血管形成和細胞自噬而起到治療RA 的作用。

綜上所述，托法替布聯合甲氨蝶呤在臨床試驗中取得了較好的療效，但是缺乏系統科學的分子機制研究。本研究采用網絡藥理學的方法，對兩者的活性成分、靶蛋白/基因和作用通路進行了深入探討，證實托法替布聯合甲氨蝶呤具有多靶點、多通路的作用特點，為后續研究提供理論依據，并未臨床應用實踐提供數據參考。由于現有數據的局限性，后期需要更多、更深入的研究為臨床應用提供科學根據。