基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討柴胡治療非酒精性脂肪性肝病機制

田新才，楊梅，趙琦，張飛，郭震凡，唐云

1.貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550003

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是以彌漫性肝細胞脂肪變性和肝臟脂肪貯積為主要病理特征的一類代謝應(yīng)激性肝損傷綜合征。越來越多的證據(jù)表明NAFLD 的形成是多因素共同作用導致的涉及多系統(tǒng)的，可能與多種內(nèi)分泌代謝疾病、病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病等共同存在的一種與代謝紊亂有關(guān)的疾病［1］。肥胖、糖尿病或其他代謝相關(guān)疾病等導致肝臟脂質(zhì)代謝失衡，游離脂肪酸（FFA）蓄積于內(nèi)，使肝細胞脂肪變性，即非酒精性單純性脂肪肝（NAFL），過多FFA 產(chǎn)生脂毒性誘導氧化應(yīng)激、胰島素抵抗導致炎癥反應(yīng)，這種作用是雙向發(fā)展的，容易形成惡性循環(huán)，造成肝臟損害，形成非酒精性脂肪性肝炎（NASH），若治療不及時，NASH 可以進一步發(fā)展為肝纖維化及肝硬化，最終激發(fā)癌癥通路，形成肝細胞癌（HCC）［2-5］。過去幾十年成人NAFLD 發(fā)病率為6.3%～45%，其中NASH 的發(fā)病率占10%～30%［6］。近年來NAFLD 的發(fā)病人數(shù)日漸增加，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)下降趨勢［7］。據(jù)調(diào)查，全球NAFLD 的流行率約為25%，兒童和青少年NAFLD 的患病率約10%，最小患者只有2 歲，最年輕的NASH 相關(guān)肝硬化患者為8 歲［8］。

因NAFLD 致病因素多，機制復雜，目前尚無治療NAFLD 特效藥，除改變生活方式、調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)之外，大多從改善胰島素抵抗、抗氧化、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)腸道菌群等方面著手治療。中醫(yī)藥辨證論治時講究“三因制宜”，即個體化治療，臨床療效顯著；經(jīng)長期臨床實踐，因其有效性及安全性被越來越多的人接受，雖臨床上療效顯著，但缺乏客觀指標和量化證據(jù)，不易推廣。

柴胡能疏散退熱，疏肝解郁,清膽截瘧，升舉陽氣［9］；《神農(nóng)本草經(jīng)》［10］稱之為“茈胡”，又名“地薰”，為上品，其“味苦，平。主心腹，去腸胃中結(jié)氣、飲食積聚、寒熱邪氣，推陳致新”。據(jù)《雷公炮制藥性解》［11］記載，“味苦，性微寒，無毒，入肝、膽、心包絡(luò)焦、胃、大腸六經(jīng)。主傷寒心中煩熱，痰實腸胃中，結(jié)氣積聚，寒熱邪氣，兩脅下痛，疏通肝木，推陳致新……凡胸腹腸胃之病因熱所致者，得柴胡引清去濁而病謝矣，故入肝膽等經(jīng)。”馬驥運用柴胡劑時增設(shè)小柴胡湯腹證，凡以“胸脅苦滿”為主證，伴胸中壅塞脹滿、心窩部發(fā)硬、肋弓下壓痛、肝區(qū)緊張?zhí)弁础⑸细菇仟M窄者均屬于此［12］。白宗利［13］、孫慧敏［14］通過對比研究發(fā)現(xiàn)醋柴胡毒性較生柴胡毒性小，保肝作用強；酒制柴胡較其他柴胡炮制品有更好的抗炎作用。綜合而言，現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，柴胡在免疫調(diào)節(jié)、臟器保護（保肝）及抑制纖維化（肝肺等）、抗炎、抗病毒、抗腫瘤以及心血管、血液系統(tǒng)等方面發(fā)揮著重要作用［15］。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學數(shù)據(jù)平臺對柴胡治療NAFLD 的有效成分及作用靶點進行分析，為中醫(yī)藥治療NAFLD 提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 柴胡活性成分及靶點預(yù)測

利用中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學平臺TCMSP 數(shù)據(jù)庫［16］（https:lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）搜索柴胡的所有化學成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及類藥性指數(shù)（drug-like index，DL）≥0.18 為基點確定藥物有效成分，然后根據(jù)Mol ID 逐一查找有效成分對應(yīng)的潛在蛋白靶點，結(jié)合Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/index.php），導入在PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得上述成分的SDF 格式化學結(jié)構(gòu)文件,限制種屬“homo sapiens”,點擊預(yù)測并導出結(jié)果,將二者所得結(jié)果合并、去重，即得到藥物活性成分靶點,再通過UniProt 數(shù)據(jù)庫［17］（http://www.uniprot.org/）對蛋白名稱進行標準化，選擇物種為“Human”，下載已證實的人類基因，利用EXCEL 表格函數(shù)對藥物靶點基因全稱進行symbol 轉(zhuǎn)換。

1.2 NAFLD 疾病相關(guān)靶點獲取

通過GeneCards［18］數(shù)據(jù)庫（https://www.Genecards.org/）以“non-alcoholic fatty liver disease”為關(guān)鍵詞檢索收集NAFLD 疾病相關(guān)靶點，納入了所有條目信息，刪除多余重復的靶點，即得到NAFLD 的相關(guān)靶點。

1.3 柴胡治療NAFLD 的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將篩選出的柴胡與NAFLD 疾病靶點輸入Draw Venn Diagram（Venn 圖）在線軟件平臺（http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/Venn/）中將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成可視化Venn 圖。再運用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建藥物-活性成分-疾病靶點的可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.4 柴胡與NAFLD 的靶點蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）分析

運用string 11.0 數(shù)據(jù)平臺（https://string-db.org/），將上傳至在線string 數(shù)據(jù)庫，設(shè)置蛋白種類為“homo sapiens”，設(shè)置最低置信度為0.7，其他參數(shù)設(shè)置不變，去掉網(wǎng)絡(luò)中的單一節(jié)點，構(gòu)建從網(wǎng)絡(luò)分析獲得的關(guān)鍵蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)。再次通過Cytoscape軟件將生成的“string interactions.tsv”文件進行拓撲學分析，根據(jù)節(jié)點的degree 和顏色深淺選出核心靶點，即獲得柴胡潛在治療靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖［19］。

1.5 GO 功能富集分析和KEGG 生物通路富集分析

GO 功能富集分析和KEGG 生物通路富集分析分別是針對各種物種的基因功能和基因產(chǎn)物在細胞中的代謝途徑及功能進行富集程度分析的一種方法。Metascape 是實驗生物學家在大數(shù)據(jù)時代全面分析和解釋當前廣泛的生物數(shù)據(jù)庫的有效工具［20］。通過Metascape 數(shù)據(jù)庫［20］對關(guān)鍵靶點進行GO 富集功能分析，如生物過程（biological process,BP），細胞成分（cellular component,CC），分子功能（molecular function,MF），獲得GO 富集分析結(jié)果（P＜0.01）；對關(guān)鍵靶點進行KEGG 信號通路富集分析，獲得顯著富集的信號通路（P＜0.01）。最后利用Cytoseape軟件對GO 富集和KEGG 富集分析數(shù)據(jù)進行處理和可視化處理,以此探討柴胡治療NASH 的生物學過程及關(guān)鍵信號通路。

2 結(jié)果

2.1 柴胡的主要有效成分及靶點預(yù)測

根據(jù)OB ≥30%及DL ≥0.18 從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中篩選出有效成分17 個，刪除其中5 個無對應(yīng)靶點的成分，最終獲得12 個唯一有效成分，見表1。

表1 柴胡主要有效成分表

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中收集12 個有效成分的預(yù)測靶點，與Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫靶點預(yù)測得出的評分值靠前的靶點合并，利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫進行標準化處理，刪除重復值，得到196 個唯一靶點蛋白。

2.2 疾病靶點獲取及繪制Venn 圖

將GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.Genecards.org/）中查詢的NAFLD 疾病相關(guān)靶點基因整理并去重，得到1 080 個與NASH 疾病的相關(guān)靶點基因；依次將柴胡與NAFLD 的靶點基因?qū)隓raw Venn Diagram（Venn 圖）在線軟件平臺繪制成Venn 圖，其中交集靶點共85 個，見圖1。

圖1 NAFLD與柴胡交集靶點Venn圖

2.3 構(gòu)建“中藥-有效成分-疾病靶點”可視化網(wǎng)絡(luò)圖

將有效成分和利用Venn 圖篩選出的疾病-藥物共有靶點蛋白通過Excel 表格的整合，通過Cytoscape 3.7.2 軟件將藥物的靶基因196 個與藥物-疾病的共同靶點85 個運用Perl 命令符取交集，得到柴胡治療NAFLD 的有效成分11 個導入Cytoscape 軟件中，得到“中藥-有效成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。圖中包括97 個節(jié)點（1 種藥物、11 個有效成分、85 個相關(guān)靶點蛋白），其中槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、異鼠李素（isorhamnetin）、乙酸亞油醇酯（Linoleyl acetate）、豆甾醇（Stigmasterol）五種有效成分的作用靶點較多；前列腺素內(nèi)過氧化物酶2（PTGS2）、一氧化氮合酶（NOS2）、乙醇脫氫酶（ADH1C）、B2 腎上腺素受體（ADRB2）、黃嘌呤脫氫酶（XDH）、B 細胞白血病/淋巴因子2（BCL2）、糖原合成酶激酶3B（GSK3B）等靶點蛋白分別有多個有效成分與之相互作用；印證了柴胡可能通過多成分、多靶點、多途徑治療NAFLD 的作用。見圖2。

圖2 柴胡治療NAFLD的“中藥-有效成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

將獲得的85 個共有靶點上傳至string 11.0 數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)平臺，設(shè)置最低置信度為0.7，其他參數(shù)設(shè)置不變，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，將生成“string interactions.tsv”文件導入Cytoscape 軟件進行拓撲學分析，結(jié)果見圖3。圖中節(jié)點代表靶點蛋白，邊代表兩者之間的聯(lián)系，degree大小代表節(jié)點連線多少，節(jié)點圓圈大小與degree 值呈正相關(guān)；顏色越深、節(jié)點越大表示靶點越關(guān)鍵；每個節(jié)點邊的數(shù)目與關(guān)聯(lián)度呈正比，每個節(jié)點的邊越多，關(guān)聯(lián)度越大。由此可得到位于前十位的靶點蛋白為絲/蘇氨酸蛋白激酶B1（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、腫瘤蛋白P53（TP53）、過氧化酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、原癌基因（JUN）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、前列腺素內(nèi)過氧化物酶2（PTGS2），其中AKT1、TNF、IL-6、IL1β 為柴胡治療NAFLD 的核心靶點。

圖3 “柴胡-NAFLD”蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 柴胡治療NAFLD 基因GO 富集分析

在GO 富集分析中根據(jù)enrichment score（富集評分）的高低，校正P值后分別繪制出細胞組分，分子功能，生物過程前20 位的富集分析結(jié)果，如圖4 所示。各部分按富集程度排序，柴胡治療NAFLD 的主要生物過程有對脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、對無機物的反應(yīng)（response to inorganic substance）、凋亡信號通路（apoptotic signaling pathway）、對異物刺激的反應(yīng)（response to xenobiotic stimulus）、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)（response to nutrient levels）、血管形態(tài)發(fā)生（blood vessel morphogenesis）、對類固醇激素的反應(yīng)（response to steroid hormone）、對肽的反應(yīng)（response to peptide）、細胞分化的負調(diào)控（negative regulation of cell differentiation）、細胞黏附的調(diào)節(jié)（regulation of cell adhesion）、平滑肌細胞增殖的調(diào)節(jié)（regulation of smooth muscle cell proliferation）、老化（aging）、對氧氣水平的反應(yīng)（response to oxygen levels）、細胞因子介導的信號通路（cytokinemediated signaling pathway）、活性氧代謝過程（reactive oxygen species metabolic process）、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)（regulation of inflammatory response）、細胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控（positive regulation of cytokine production）、對紫外線的反應(yīng)（response to UV）、內(nèi)在凋亡信號通路（intrinsic apoptotic signaling pathway）、神經(jīng)元死亡的調(diào)節(jié)（regulation of neuron death）；細胞組分主要有膜筏（membrane raft）、細胞外基質(zhì)（extracellular matrix）、膜面（side of membrane）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復合體（transcription regulator complex）、軸突（axon）、細胞質(zhì)核周區(qū)（perinuclear region of cytoplasm）、囊泡腔（vesicle lumen）、細胞器外膜（organelle outer membrane）、核膜（nuclear envelope）、蛋白激酶復合物（protein kinase complex）、晚期內(nèi)體（late endosome）、富含 ficolin-1 的顆粒管（ficolin-1-rich granule lumen）；主要分子功能有DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（DNA-binding transcription factor binding）、蛋白質(zhì)同二聚化活性（protein homodimerization activity）、蛋白激酶結(jié)合（protein kinase binding）、氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）、細胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）、蛋白酶結(jié)合（protease binding）、絲氨酸水解酶活性（serine hydrolase activity）、核受體活性（nuclear receptor activity）、肽結(jié)合（peptide binding）、組蛋白脫乙酰酶結(jié)合（histone deacetylase binding）、激酶調(diào)節(jié)活性（kinase regulator activity）、整合素結(jié)合（integrin binding）、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合（tumor necrosis factor receptor superfamily binding）、細胞外基質(zhì)結(jié)合（extracellular matrix binding）、趨化因子受體結(jié)合（chemokine receptor binding）、黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合（flavin adenine dinucleotide binding）、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性（nitric-oxide synthase regulator activity）、R-SMAD 綁定（R-SMAD binding）、NF-κB結(jié)合（NF-kappaB binding）。

圖4 柴胡治療NAFLD的GO富集分析

2.6 柴胡治療NAFLD 的KEGG 通路富集分析

通過KEGG 信號通路富集分析得出柴胡治療NAFLD 的信號通路主要涉及炎癥、抗癌等方面，如癌癥通路（pathways in cancer）、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、丙型肝炎（hepatitis C）、HIF-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）、大腸癌（colorectal cancer）、內(nèi)分泌抵抗（endocrine resistance），詳見圖5。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，癌癥通路（Pathways in cancer）含有37 個靶點，是含有靶點最多的通路。

圖5 柴胡治療NAFLD的KEGG通路富集分析

3 討論

中醫(yī)古籍中關(guān)于NAFLD 的論述，最早的記載見于《難經(jīng)》，稱之為“肥氣”；《濟生方》卷四：“肥氣之狀……診其脈，弦而細，其色青，其病兩脅下痛，牽引小腹，足寒轉(zhuǎn)筋，男子為積疝，女子為瘕聚”。根據(jù)其病因、病機、癥狀，可將其歸屬于“肝癖”“積聚”“脅痛”“肥氣”“肝脹”等范疇。《非酒精性脂肪肝病中醫(yī)診療專家共識（2017）》［21］將NAFLD 命名為“肝癖”,認為其主要病因大體可歸納為五點：飲食不節(jié)、情志失調(diào)、勞逸失度、久病體虛、稟賦不足。《非酒精性脂肪肝病中醫(yī)診療指南》［22］指出本病病位涉及脾、肝、腎三臟，與痰、濕、濁、瘀、熱等病理因素有密切關(guān)系，證屬本虛標實，肝脾腎三臟功能失調(diào)為本，痰濁血瘀為標。《金匱要略》有云:“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”，經(jīng)數(shù)據(jù)挖掘研究發(fā)現(xiàn)［23-24］，治療NAFLD 的藥物主要歸于藥物歸經(jīng)以肝、脾二經(jīng)為主，柴胡為治療NAFLD 的主要藥物之一，對肝臟有良好的保護作用。

通過“藥物-成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖”中Degree 值得出，槲皮素、山柰酚、豆甾醇、異鼠李素、乙酸亞油醇酯為柴胡治療NAFLD 的主要活性成分。槲皮素、山柰酚、異鼠李素均屬于黃酮類化合物，黃酮類化合物廣泛存在于各種植物、水果、蔬菜中，具有良好的抗腫瘤、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抑制胰島素抵抗、保護心腦血管作用，在臨床上運用廣泛［25］。槲皮素是柴胡治療NAFLD 的主要有效成分之一，多項研究表明槲皮素可通過調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)基因、炎癥相關(guān)基因的表達,減輕肝臟的氧化應(yīng)激，減少脂質(zhì)合成，減少肝臟脂質(zhì)蓄積，改善肝細胞脂肪變性；同時能改善胰島素抵抗［26-31］。在肝臟中，山柰酚可以上調(diào)PTEN、caspase-3、JAK1、Tyk2、STAT1/2、內(nèi)源性IFN-α 調(diào)節(jié)基因表達，下調(diào)線粒體膜電位、SOCS3、STAT3、miR-21、PI3K/AKT/mTOR 信號通路、磷酸肌醇 3-激酶 (PI3K)/AKT（蛋白激酶B）和人類 T 細胞白血病/淋巴瘤病毒-I（HTLV-I）信號通路來達到抗炎抗氧化，并抑制 NFκB 通路、下調(diào)相關(guān)標志物蛋白質(zhì)的表達來誘導癌細胞凋亡，從而達到抗癌目的［32-34］。

由KEGG 通路富集分析和PPI 互作圖可看出，AKT1、TNF、IL-6、IL-1β、TP53、PPARG、CASP3、JUN、VEGFA、PTGS2 與柴胡治療NAFLD 存在密切聯(lián)系，其主要通路涉及癌癥通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、丙型肝炎、HIF-1信號通路、大腸癌、內(nèi)分泌抵抗等。研究顯示，AKT1 為一種存在大多數(shù)癌癥中過度表達的原癌基因，是多種人類惡性腫瘤的標志，AKT 調(diào)控的通路是人類癌癥中最常被激活的信號通路［34-36］。TNF 是一種促炎因子，在炎癥反應(yīng)及多種細胞功能中起關(guān)鍵作用，如凋亡、增殖、線粒體動力學等［37］。研究表明TNF 能抑制抗炎細胞因子脂聯(lián)素，減弱機體對胰島素敏感性，發(fā)生胰島素抵抗；而且肝臟纖維化程度與TNF 的表達水平成正比［38-39］。IL-6 既是細胞因子，又是免疫調(diào)節(jié)因子、脂肪因子，NAFLD 的發(fā)生發(fā)展與IL-6 和TNF-α 有密切關(guān)系，與胰島素抵抗呈正相關(guān)［40-41］。通過動物及體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，山柰酚通過降低CASP3 蛋白的表達水平，減少氧化應(yīng)激導致的肝細胞凋亡通路的激活，抑制肝纖維化的發(fā)展，減慢或緩解NAFLD 的發(fā)生發(fā)展［42-43］。結(jié)合GO 富集分析進一步研究柴胡治療NAFLD 的作用機制，分析結(jié)果表明柴胡通過對脂多糖的反應(yīng)、對無機物的反應(yīng)、凋亡信號通路、對異物刺激的反應(yīng)、血管形態(tài)發(fā)生、對氧氣水平的反應(yīng)、細胞因子介導的信號通路、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、細胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控等生物過程及DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚化活性、蛋白激酶結(jié)合、氧化還原酶活性、細胞因子受體結(jié)合、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合等分子反應(yīng)上，進而調(diào)控癌癥通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化和HIF-1 信號通路等發(fā)揮柴胡對肺癌細胞的抑制作用。HIF-1 信號通路中通過減少HIF-1信號通路中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、低氧誘導因子1α 蛋白表達,上調(diào)血管內(nèi)皮因子A 蛋白表達而調(diào)節(jié)機體的細胞凋亡、炎癥反應(yīng)、血管生成、對氧氣水平的反應(yīng)等多種生物功能,達到保護肝臟的目的［44］。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學這一研究工具，初步分析了柴胡治療NAFLD 的作用機制，共涉及槲皮素、山柰酚、豆甾醇、異鼠李素等11 種有效成分，AKT1、TNF、IL-6、CASP3 等多靶點與癌癥途徑、HIF-1 信號通路等多通路參與的細胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)的治療機制。本研究從藥理作用及作用機制方面闡述了柴胡治療NAFLD的科學依據(jù)，但藥物單一，需進一步考慮中藥復方的復雜性及患者的個體差異性。