復方牙痛酊對牙周炎模型大鼠的保護作用

羅詩豪，周志軍，胡靜，曾憲晶

井岡山大學附屬醫院，江西 吉安 343000

牙周炎是由多種因素引起的牙周組織的慢性感染，以牙齦炎癥和牙槽骨破壞為主要表現，嚴重者可導致牙齒松動，甚至脫落。作為成年人失牙最主要的病因，一項調查報告指出：牙周炎在世界范圍內高發，涉及各個年齡段，患者人口占比高達全球人口的10%［1］。當前牙周炎以牙周基礎治療為主，配合局部或全身藥物治療。近年來研究發現，基質金屬蛋白酶（MMPs）基因的功能多態性與牙周炎風險性的增加密切相關，在骨破壞及重塑中發揮重要作用［2］。炎性因子水平與牙周炎嚴重程度成正比,可用于預測慢性牙周炎的預后［3］。研究表明［3-4］：一些中藥及其提純的有效成分可通過抑制MMPs 活性，減輕炎性反應而起到治療牙周炎的作用。本實驗以MMPs 相關蛋白及炎性因子為研究切入點，探討復方牙痛酊對實驗性牙周炎大鼠的影響，為臨床應用提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗試劑與儀器

牙齦卟啉單胞菌（北京北納生物技術研究院）；脂多糖溶液（武漢博士德生物科技有限公司，2021A125）；鹽酸米諾環素溶液（上海美優制藥廠，H10950348）；復方牙痛酊（貴州同濟堂制藥公司，Z20025807）；水合氯醛（中國醫藥集團有限公司，20201206）；ELISA 檢測試劑盒（北京伊塔生物科技有限公司）；RIPA 裂解液（武漢博士德生物科技有限公司）；酶標儀（TC1000-S，美國賽默飛）；體視顯微鏡（蘇州南光光學儀器公司）；移液器（德國eppendorf 公司），SD 大鼠（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司）。

1.2 動物造模與分組

將35 只健康成年SPF 級SD 大鼠，體質量（250±50）g，鼠齡范圍10～12 周，雄雌比為18∶17，實驗單位使用許可證編號為SYXK（贛）2012-0001，生產許可證號SCXK（湘）2016-0002，動物房內適應性喂養1 周后轉入實驗造模，本實驗通過動物倫理審查。將大鼠分為造模組（30 只）和空白組（5 只），其中空白組正常喂養，未行任何處理。造模組大鼠通過磨牙結扎和牙齦卟啉單胞菌感染誘導牙周炎，采用文獻［5-6］記錄的操作方法對大鼠進行造模：用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取4-0 絲線結扎雙側上頜第1 磨牙的頸部區域，之后用移液器每隔2 天將含2 μL 牙齦卟啉單胞菌和15 μL 脂多糖溶液的生理鹽水均勻注入到大鼠齦溝內絲線處，連續造模4 周，每日觀察牙齦情況。大鼠造模成功標準參考文獻［7］記錄方法：大鼠牙齦組織內可見炎性細胞浸潤，結締組織中膠原纖維破壞，結合上皮向根部增生，牙周袋加深；牙槽骨結構疏松，骨吸收陷窩形成，破骨細胞數量明顯增多。

本次實驗共篩選出符合模型要求大鼠24 只。將造模后的大鼠染色標號，采用隨機數字表法分3 組：模型組、對照組、實驗組，每組各8 只。給藥方法：模型組灌胃等量的生理鹽水，對照組按45 mg/kg 灌服等量的鹽酸米諾環素溶液，實驗組按500 mg/kg 灌胃復方牙痛酊（貴州同濟堂制藥公司，國藥準字Z20025807，規格：50 mL/瓶），給藥劑量參照人與動物體表面積折算的等效劑量系數折算法［8］。每日給藥2 次，連續灌胃給藥4 周，直至取樣節點。

1.3 檢測方法

（1）ELISA 法檢測血清MMPs 及炎性因子水平，各組大鼠尾靜脈采集血液樣本，采用蛋白裂解液提取總蛋白，置入酶標板孔中，滴入生物素標記抗體，加入ABC 工作液，TMB 顯色，酶標儀在波長450 nm 測定各孔的OD 值，繪制標準曲線。（2）大鼠牙槽骨吸收測定，大鼠麻醉后處死，逐步分離上頜骨組織，接著放入亞甲藍染液中染色2 min，用體視顯微鏡觀察上頜骨形態變化，測量第一至第三磨牙處釉牙骨質界到牙槽嵴頂的距離，把其平均值作為該牙牙槽骨吸收值。（3）熒光染色：首先配制膠原纖維染色苦味酸天狼猩紅染液，切片脫蠟，乙醇梯度脫水，漂洗，苦味酸天狼猩紅染液染色后漂洗，脫水，透明，封固，偏振光熒光顯微鏡下觀察切片。（4）HE 染色：切片制作與染色，收集各大鼠上頜第1 磨牙的牙齦組織，置于4%多聚甲醛的BS 中固定，常規脫鈣，接著脫水透明，浸蠟包埋，制作切片，常規HE 染色后，使用電子顯微鏡在10×20的視野下觀察細胞形態病理變化。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠造模后體質量比較

造模前，各組大鼠的體質量差異無統計學意義（P＞0.05）。造模4 周后空白組大鼠體質量為（274.1±24.1）g，造模組體質量為（269.9±23.7）g，兩組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 大鼠造模前后牙齦對比

圖1 為實驗性牙周炎大鼠造模前后對比圖，其中圖1A 造模前大鼠牙齦未見明顯紅腫；圖1B 造模成功后大鼠牙齦可見明顯紅腫，并出現較深的牙周袋，食物殘渣堆積；圖1C 造模前大鼠牙周組織膠原纖維分布均勻、致密、方向較一致，邊界較完整；圖1D 造模成功后大鼠膠原纖分布不均勻、疏松，排列紊亂，并可見黑色吸收空洞；圖1E 造模前大鼠牙齦上皮結構完整，結合上皮、溝內上皮結構正常；圖1F 造模后牙周組織中炎癥破壞明顯，結合上皮向根部增生。

圖1 實驗性牙周炎大鼠造模前后對比圖

2.3 各組大鼠牙槽骨吸收測定

空白組釉牙骨質界到牙槽靖頂之間的距離未見異常，與空白組相比，模型組、對照組、實驗組大鼠釉牙骨質界到牙槽嵴頂距離顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，對照組、實驗組大鼠釉牙骨質界到牙槽嵴頂距離減少（P＜0.05）；與對照組比較，實驗組大鼠釉牙骨質界到牙槽嵴頂距離減少（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠釉牙骨質界到牙槽嵴頂距離（mm，）

表1 各組大鼠釉牙骨質界到牙槽嵴頂距離（mm，）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與對照組比較，cP＜0.05。

2.4 各組大鼠血清MMPs 及炎性因子水平結果

與空白組相比，模型組大鼠血清MMPs 及炎性因子（TNF-α，IL-6，IL-8）明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，對照組、實驗組血清MMPs 及炎性因子降低（P＜0.05）；與對照組比較，實驗組大鼠血清MMPs 及炎性因子降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清MMPs及炎性因子水平結果（ng/mL，）

表2 各組大鼠血清MMPs及炎性因子水平結果（ng/mL，）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與對照組比較，cP＜0.05。

2.5 HE 染色結果

空白組牙齦組織中細胞形態正常、結構完整，可見復層鱗狀上皮細胞，牙周膜內膠原纖維形態結構規整，排列有序，見圖2A。模型組牙齦組織中細胞結構破壞，排列不齊，牙周膜內膠原纖維變性、破壞，伴大量炎性細胞浸潤分布，并有微小膿腫形成，骨內見大量的破骨細胞，深牙周袋形成，見圖2B。對照組（圖2C）及實驗組（圖2D）均可見細胞結構稍完整，排列較齊，膠原纖維結構破壞減輕，仍伴炎性細胞浸潤，破骨細胞數目減少；較對照組而言，實驗組整體病理損傷減輕。

圖2 各組大鼠牙齦組織HE染色結果（×200）：A為空白組；B為模型組；C為對照組；D為實驗組

3 討論

目前關于牙周病的病因和發病機制尚未完全闡明，研究顯示MMPs 及免疫炎性反應與牙周病的發病密切相關，MMPs 被認為是牙周炎過程的重要調控因子，介導炎癥反應過程［9］。MMPs 共有28 個成員，作為鋅和鈣依賴性細胞外蛋白水解酶中的一種分泌酶，能夠降解大部分細胞外基質［7］。MMPs通常分成五類不同的酶（明膠酶、膠原酶、膜型MMPs、基質蛋白酶、其他蛋白酶），研究已經證明［10］在牙本質中含有明膠酶（MMP-2、MMP-9），它們由成牙本質細胞產生并分泌到細胞外基質中，不僅參與牙胚時期牙本質有機質形成和礦化的調控，還參與牙齒增齡性變化、牙本質修復等生理過程，并參與了某些病理過程如齲病、牙周病等的發展過程［11］。MMPs 不僅在健康牙本質有特異性表達，在齲壞的牙本質中也呈現出不同的表達狀態，甚至表現出更高的活性［12］。本實驗結果模型組MMPs 表達明顯升高，印證了上述結論。MMPs與牙周病損傷密切相關。究其作用途徑，其一是細菌產酸使口腔內環境pH 值降低，繼而激活MMP-2和MMP-9。當pH 值為4.5 時，其活性可提高4 倍，在一定范圍內，其分解膠原蛋白的能力與pH 值成正比，齲壞牙齒暴露于口腔中時，唾液的緩沖作用使得MMPs 處于接近中性的環境中，MMPs 才能較大程度地促進齲病發展［13］。其二，口腔中含有膠原結合黏附素的變異鏈球菌能夠直接激活MMP-9，導致牙周損傷。同時，牙周局部炎癥會破壞上皮的完整性，使牙周袋內的炎癥遞質如白細胞介素等細胞因子從牙周袋進入血液循環系統和外周免疫器官，引起系統性炎癥反應［14］。TNF 是牙周組織破壞中重要的致炎細胞因子，從牙周炎微環境炎性細胞的遷移到組織的破壞它都參與，刺激參與趨化因子細胞遷移到感染和炎癥部位增強免疫反應，通過上調IL-1β 和IL-6 的表達促進MMPs 的表達，從而增加破骨細胞活性和降低成骨細胞活性導致牙周炎組織破壞［15-16］。IL-6 是病原體刺激促炎細胞因子誘導炎癥反應的放大因子，能夠促進淋巴B 細胞分化和促進炎癥的發生，在免疫反應中起到促炎作用［17］。IL-8 通過激活中性粒細胞，釋放一系列的活性產物，最終導致機體局部的炎癥反應［18］。本實驗在切片上觀察模型組損傷最明顯，實驗組和對照組均可抑制造模劑所致的牙齦損傷，且實驗組在減輕大鼠牙齦癥狀方面優于對照組，MMPs 和炎性因子水平更低，提示復方牙痛酊通過抑制MMPs 和炎性因子釋放而發揮作用。

鹽酸米諾環素具有高效抗菌作用，且易滲透，在臨床上常采用米諾環素治療牙齦炎，該藥屬于四環素衍生物類抗生素，具有強效抑菌作用，且藥效持久，對革蘭陰性菌、放線菌等多類病原菌具有良好抑制作用，還可干擾膠原酶活性，降低牙齦組織破壞程度［19］。牙周病屬中醫“牙宣、齒槁”等病范疇，最早在《黃帝內經》中記載:“足少陰氣絕則骨枯……肉軟卻故齒長而垢”，描述了牙周炎牙齦萎縮、牙根外露、牙垢附著等表現。究其病因，或飲食偏嗜，或酒煙不節，勞傷脾胃，致內濕蓄積，阻滯氣機，漸至壅盛，蓄久化熱，濕熱上蘊口竅致牙周炎，其治療方法當以祛風除濕、泄熱解毒、散瘀止痛為主［4］。復方牙痛酊中寬葉纈草祛風除濕，行氣活血止痛；鳳仙花祛風通絡、清熱解毒，活血止痛；紅花活血散瘀止痛；樟木清熱殺蟲，理氣通絡止痛，諸藥合用，共奏活血散瘀、消腫止痛之功效。楊家龍等［20］研究顯示復方牙痛酊對口腔常見致病菌標準株有殺菌作用，對牙齦卟啉單胞菌的抑制作用最強，臨床研究亦證實復方牙痛酊有較好的消炎、鎮痛效果。本研究結果顯示，復方牙痛酊治療牙周炎的綜合療效優于鹽酸米諾環素，具有較好地治療效果。

綜上研究表明，復方牙痛酊通過抑制MMPs 和炎性因子釋放，這可能是復方牙痛酊發揮作用的機制之一。