抗菌肽RISE-AP12?對鈦種植體周圍炎主要致病菌和生物膜生長的抑制作用研究

呂金瑩，胡欣，鄧嘉胤

（天津醫科大學口腔醫學院牙周科，天津 300070）

種植體周圍炎是指發生在口腔種植體周圍軟組織的可逆炎癥，是以種植體上的細菌微生物感染為特征的炎性疾病[1]。目前種植體周圍炎的治療手段都是基于牙周炎治療的一般原則，包括消除細菌微生物群，防止細菌定植和創造一個能夠抑制齦下細菌的生態環境[2-3]。種植體周圍炎的常規治療手段包括機械治療和化學藥物治療，因為機械治療無法徹底清除粗糙表面的細菌，再加上抗生素具有較廣的抗菌譜，容易誘發菌群失衡，所以治療效果都不理想[4]。抗菌肽是生物細胞特定基因編碼，是機體抵抗病原微生物時誘導產生的一類帶正電荷的防御性小分子多肽，具有穩定性高、抗菌譜廣等優點[5-6]。RISE-AP12?是一種人工合成的新型抗菌肽，具有較好的生物學活性與較強的抗菌作用，且不易產生耐藥性，安全性更高，在種植體周圍炎的應用中具有較大的優勢[7-8]。本研究旨在探討分析不同濃度的抗菌肽RISE-AP12?對鈦種植體周圍炎主要致病菌和生物膜生長的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗菌株包括血鏈球菌（ATCC10556），牙齦卟啉單胞菌（ATCC33277），具核梭桿菌（ATCC10953）。

主要試劑與儀器包括鈦種植體（Ti6Al4V，規格：Φ3 mm×7 mm）；抗菌肽RISE-AP12?（由北京銳瑟生物醫藥科技發展有限公司合成提供）；電熱恒溫培養箱（上海躍進HDPN-II-256 型）、低溫離心機（Grows Instrument TGL27A 型）、酶標儀（美國ThermoFisherScientific）、厭氧培養箱（上海躍進YQX-Ⅱ型）、CO2細胞培養箱（上海龍躍WJ-3-160T 型）。

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽RISE-AP12?藥液的制備 用腦心浸液瓊脂（BHI）培養基將抗菌肽培養成濃度為0.1 g/L的母液，經針孔濾器過濾消毒后儲存于-20℃備用。

1.2.2 實驗菌種的復蘇與培養 將具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌復蘇后接種于BHI 培養基，37℃下專性厭氧環境培養48 h，血鏈球菌復蘇后于37℃下微需氧環境培養24 h。抽取菌落革蘭染色后進行生化鑒定，確認為純菌無污染后進行傳代培養，配制成2.0×106CFU/mL 菌懸液保存備用。

1.2.3 檢測最小抑菌濃度（MIC）與最小殺菌濃度（MBC） 對數生長期的菌液，調整抗菌肽RISE-AP12?濃度為40、35、30、25、20、15、10、5、2.5 mg/L。各取100 μL 菌懸液與藥液接種于96 孔板，置于培養箱中過夜培養觀察。置于黑色背景中，若肉眼觀察無細菌生長孔清亮且對應的最小用藥濃度時即為MIC 值；當菌落數少于5～6 個時對應的最低濃度即為MBC 值[9]。進行3 次平行實驗。

1.2.4 kill-time 曲線測定與繪制 菌液與藥液1∶1混合后，取50 μL 用三蒸水稀釋10 倍，取稀釋后的25 μL 進行涂布，置于專性厭氧環境中繼續培養24～48 h。分別檢測1、2 MIC 濃度時的抑菌效果。選取BHI 培養基+菌懸液為陰性對照，選取BHI 培養基+復方氯己定漱口液作為陽性對照。以log CFU/mL 為縱坐標，時間為橫坐標，進行kill-time 曲線的繪制。進行3 次平行實驗。

1.2.5 生物膜制備及分組 將鈦片切割研磨后，用無水乙醇與去離子水超聲20 min，超聲微弧氧化后，經3 mol/L 的NaOH 處理，于60℃浸泡1 h，晾干。調節pH 至7 時，使用KH-550 硅烷聯劑超聲，再浸入硅烷溶液中浸泡30 s，干燥后待用。收集口腔狀況良好、無吸煙史且近期未服用藥物的10 名志愿者唾液，男性5 名，女性5 名，平均年齡（40.6±1.6）歲，以4 500 r/min 離心30 min 后取上清液，過濾除菌后備用。將鈦片消毒后置于唾液中24 h，形成膜后，轉至24 孔板培養，加入500 μL 菌液、1 500 μL 培養基，于相應培養環境培養24～48 h。PBS 沖洗3 次后于戊二醛固定24 h，采用梯度酒精洗脫。取出制備的生物膜置于24 孔板中，分別加入40、20、10、5、2.5 mg/L 的抗菌肽RISE-AP12?、無菌生理鹽水與0.6 g/L 復方氯己定漱口液的培養基1 000 μL，制備生物膜。應用酶標儀測定630 nm 處的OD 值。生物膜清除率=（藥物處理后OD 值-無菌生理鹽水OD 值）/無菌生理鹽水OD 值×100%。進行3 次平行實驗。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0 統計軟件對本次研究的數據結果進行分析，正態分布的計量資料用±s 表示，采用單因素方差分析，兩兩比較應用LSD-t 檢驗方法，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抗菌肽RISE-AP12?對主要致病菌的影響 根據MIC 和MBC 定義，判定各致病菌的MIC 和MBC，具體數據見表1。

表1 抗菌肽RISE-AP12?對主要致病菌的影響Tab 1 Effect of antimicrobial peptide RISE-AP12 ? on main pathogenic bacteria

2.2 抗菌肽RISE-AP12?作用種植體周圍炎主要致病菌的kill-time 曲線 kill-time 曲線發現，在1 MIC 和2 MIC 時均具有較好的殺菌作用，2 MIC的抑菌作用顯著強于1 MIC 與陽性對照組（具核梭桿菌：t=1.653、1.763，P=0.013、0.008；牙齦卟啉單細胞菌：t=0.984、1.271，P=0.005、0.007；血鏈球菌：t=1.548、2.187，P=0.023、0.002），見圖1～3。

圖1 抗菌肽RISE-AP12?作用具核梭桿菌的kill-time 曲線Fig 1 Kill-time curve of antimicrobial peptide RISE-AP12? on Fusobacterium nucleatum

2.3 抗菌肽RISE-AP12?對鈦種植體周圍炎主要致病菌生物膜的影響 隨著抗菌肽RISE-AP12?的濃度增加，其對具核梭桿菌、牙齦卟啉單細胞菌、血鏈球菌生物膜的清除率也隨之增強。當抗菌肽RISE-AP12?濃度為40 mg/L 時，對生物膜的抑制作用最強，清除率顯著高于0.6 g/L 復方氯己定漱口液組（具核梭桿菌：t=2.768，P=0.032；牙齦卟啉單細胞菌：t=0.676，P=0.014；血鏈球菌：t=0.794，P=0.025），見圖4～6。

圖2 抗菌肽RISE-AP12?作用牙齦卟啉單細胞菌的kill-time 曲線Fig 2 Kill-time curve of antimicrobial peptide RISE-AP12?on Porphyromonasgingivalis

圖3 抗菌肽RISE-AP12?作用血鏈球菌的kill-time 曲線Fig 3 Kill-time curve of antimicrobial peptide RISE-AP12?on Streptococcus sanguis

圖4 抗菌肽RISE-AP12?對具核梭桿菌生物膜的影響Fig 4 Effect of antimicrobial peptide RISE-AP12?on Fusobacterium nucleatum biofilm

圖5 抗菌肽RISE-AP12?對牙齦卟啉單細胞菌生物膜的影響Fig 5 Effect of antimicrobial peptide RISE-AP12?on Porphyromonasgingivalis biofilm

圖6 抗菌肽RISE-AP12?對血鏈球菌生物膜的影響Fig 6 Effect of antimicrobial peptide RISE-AP12?on Streptococcus sanguis biofilm

3 討論

隨著種植體的使用量不斷增加，種植體周圍炎也變得越來越普遍，關于種植體周圍炎的病因學研究越來越受到專家學者的關注[10]。最先認為種植體周圍炎發生的原因在于從力學角度出發，認為植入體不能很好負荷咀嚼帶來的外力。但是隨著研究不斷深入，人們發現減少力學因素的影響后并不能減少種植體周圍炎的發生。種植體周圍炎是慢性發展的過程，骨質進行性破壞，在其發展過程中，菌斑的聚集以及生物膜內部復雜的相互關系與宿主炎性反應的發生、發展密不可分，因此細菌菌落的研究變得越來越熱門[11]。其中，具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌、厭氧菌及螺旋體、福賽坦菌、齒垢密螺旋體等被認為是與種植體周圍炎發生最為密切的菌落[12]。在上述眾多的細菌庫中，血鏈球菌是最早定植于牙面的一種細菌，在齦上和齦下菌斑中都可檢出，可以與多種細菌發生聚集反應[13]。具核梭桿菌是口腔中常見共生細菌，在生物膜中具有共聚反應，可通過黏附素對各個時期細菌的定植進行整合[14]。牙齦卟啉單胞菌是導致種植體周圍炎的主要致病菌之一，其齦下的定植需要早期定植菌的存在，如鏈球菌等。其侵入宿主后可以改變自身基因，抑制中性粒細胞活性，參與生物膜的形成和宿主防御的調節，被認為是重點研究的細菌病原體[15]。因此，選擇上述3 種菌種作為本實驗的研究對象。

本研究發現，抗菌肽RISE-AP12?對具核梭桿菌的MIC 值最低；對牙齦卟啉單細胞菌的MBC 值最低；而對血鏈球菌的抑制、殺菌作用相對較弱，這可能是由于血鏈球菌具有雙重特性，其代謝產物對厭氧菌可產生拮抗作用，其MIC、MBC 值最高，分別為20、35 mg/L。一般抗菌藥物可呈時間依賴性或濃度依賴性具有殺菌或抑菌作用，本研究進一步繪制抗菌肽RISE-AP12?作用的時間殺菌曲線。根據抗菌肽RISE-AP12?作用于具核梭桿菌、牙齦卟啉單細胞菌與血鏈球菌的kill-time 曲線發現，在1 MIC和2 MIC 時均具有較好的殺菌作用，2 MIC 的抑菌作用顯著強于1 MIC 與陽性對照組，且差異具有統計學意義。較高濃度的抗菌肽RISE-AP12?抑菌作用更強。值得注意的是，隨著作用時間延長，抗菌效果并沒有持續增長，表明抗菌肽的抗菌作用可能為劑量依賴性，而非時間依賴性。

細菌生物被膜是指細菌相互黏附于接觸表面，通過分泌的因子將其自身包繞其中而形成的大量細菌聚集膜樣物[16]。細菌生物被膜中的細菌可以采用多種生存策略來逃避宿主的防御，并且擁有著維系共生制衡關系的各種因子，抗菌素想摧毀這樣的微生態是相當有難度的[17-18]。研究發現，隨著抗菌肽RISE-AP12?的濃度增加，其對具核梭桿菌、牙齦卟啉單細胞菌、血鏈球菌生物膜的清除率也隨之增強，顯示出較好的抗菌作用。當抗菌肽RISEAP12?濃度為40 mg/L 時，對生物膜的抑制作用最強，清除率顯著高于0.6 g/L 復方氯己定漱口液組，且差異具有統計學意義。目前抗菌肽對細菌細胞膜的作用機制仍不完全清楚。目前提出有孔洞學說（the barrel-stave model）、可變“毯”學說（the carpet model）、離子通道學說（the aggregate channel model）。此外，還有很多研究認為，抗菌肽對細菌細胞膜的作用僅是開始，很多抗菌肽對細菌的殺傷作用都伴隨著細胞內的一系列反應。很多抗菌肽都能穿過細菌生物膜，分別與細胞內不同組織結合，產生破壞作用，進而實現對于細菌的抑制作用。目前對于抗菌肽RISE-AP12?來說，雖得知其有一定抗菌作用，但是其具體機制還需要進一步研究。

綜上所述，抗菌肽RISE-AP12?可以抑制鈦種植體周圍炎主要致病菌具梭核桿菌、血鏈球菌以及牙齦卟啉單胞菌生長，同時可以抑制生物膜生長，從而控制鈦種植體周圍炎的發生。