超高效液相色譜法測定蟹苗中孔雀石綠的殘留

◎ 汪 杰，鄭 丹，楊家鋒，梁芹芹，方 磊

（寧波市海洋與漁業研究院，浙江 寧波 315000）

孔雀石綠是有毒的三苯甲烷類化學物，可以殺寄生蟲和殺菌，可用于化工染料。此外，孔雀石綠還能夠在養殖水產中治療三代蟲病、車輪蟲病、鰓霉病、指環蟲病、斜管蟲病、小瓜蟲病和其他一些細菌性疾病，曾經在水產養殖業普遍使用。但孔雀石綠及其代謝產物無色孔雀石綠具有高毒性殘留，容易致畸、致癌。在水產養殖中農業農村部已將孔雀石綠列為禁藥，無公害水產品中食品標準漁藥殘留限量規定不得檢出孔雀石綠及其代謝產物無色孔雀石綠[1]。

蟹類是寧波水產品養殖主導產業之一，是人們食用水產品的主要成分之一，因此保證蟹類產品的食用安全對于保障人們身體健康和水產品出口意義重大。隨著人們對食品安全的關注以及政府部門對食品安全監管的重視，測定蟹苗中孔雀石綠有重要意義[2]。

現階段檢測水產品中孔雀石綠及其代謝物的方法主要為高效液相色譜法、超高效液相色譜-串聯質譜法、酶聯免疫吸附測定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）等[3-4]。實驗通過空白樣品加標提取液配制標準工作曲線來排除樣品的基質效應干擾，使用乙腈提取、硼氫化鉀還原、離心、旋轉蒸發，過中性氧化鋁柱-PRS小柱串聯裝置，洗脫過微孔濾膜上機測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

高效液相色譜-熒光檢測器，1200LC，美國安捷倫科技有限公司；漩渦混勻儀，MS3，德國IKA公司；臺式離心機，DL-8M，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；旋轉蒸發儀，R215，瑞士BUCHIR公司；分析天平，BP211D，感應量0.001 g，德國賽多利斯公司；色譜柱，kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），瑞典AKZO NOBEL公司。

1.2 材料與試劑

甲醇、乙腈，色譜純，天地。

1.0 mol·L-1對-甲苯磺酸：稱取17.2 g一水-對甲苯磺酸，并用水稀釋到100 mL；二甘醇；固相萃取柱：中性氧化鋁柱，1 g，Sμpeclean LC-alμmina-N，或相當者，PRS小柱。

1.3 溶液配制

（1）醋酸鹽緩沖液配制。稱取4.95 g無水醋酸鈉和0.95 g對甲苯磺酸溶解于900 mL純水中，用冰醋酸調節pH=4.5，最后用水稀釋到1 000 mL。稱取12 g鹽酸羥胺溶解在50 mL水中配制成20%鹽酸羥胺水溶液。用移液槍移取1 mL20%鹽酸羥胺水溶液至100 mL容量瓶中，用甲醇準確定容至刻度線，配制成0.2%鹽酸羥胺甲醇溶液。

（2）標準溶液配制。標準品無色孔雀石綠標準物質：純度＞98%。用天平準確稱取適量的無色孔雀石綠標準物質，并用純甲醇溶解成濃度為100 μg·mL-1的標準物質儲備液。準確移取上述標準儲備液，用純甲醇稀釋成濃度為20 ng·mL-1的標準使用液。

1.4 提取

用50 mL離心管稱取5.0 g蟹苗樣品，離心管內加入20%鹽酸羥胺水溶液1.0 mL、1.0 mol·L-1對-甲苯磺酸溶液2.0 mL、乙鹽緩沖液3.0 mL，用勻質機以15 000 r·min-1的速度均質40 s，然后加入10 mL提取劑和10 g酸性氧化鋁在搖床中振搖3 min。將離心管置于離心機內以4 000 r·min-1的速度離心5 min。把上清液轉移至加有3 mL二甘醇的新50 mL離心管中，然后在原50 mL離心管中加入10 mL提取劑，重復上述操作，將上清液合并至新50 mL離心管中。加入0.5 mL硼氫化鉀溶液還原5 min。

1.5 凈化

在新的塑料離心管中加入10 mL二氯甲烷，混勻10 s后，離心機內3 000 r·min-1離心5 min。用尖嘴移液管把下層溶液移取到100 mL雞心瓶中，再用二氯甲烷10 mL再提取一次，合并提取液于同一雞心瓶中。用旋轉蒸發控制水浴溫度40 ℃，最后剩下約1 mL，加入5 mL乙腈溶解清洗雞心瓶內壁。

安裝固相萃取裝置上端固相萃取小柱（中性氧化鋁）連接下端固相萃取小柱（PRS），先用純乙腈10 mL活化小柱，把雞心瓶中的溶液移取至其中，自然過濾，再用5 mL乙腈溶解清洗雞心瓶內壁，過固相萃取裝置，棄去廢液。洗耳球壓干，按順序準確用2 mL流動相、1 mL0.2%鹽酸羥胺甲醇溶液，洗脫下端PRS柱，收集洗脫液混勻過0.45 μm的微孔濾膜，待高效液相色譜測定。

1.6 液相色譜條件

FLD檢測器激發波長：265 nm；發射波長：360 nm；色譜柱：kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-乙酸緩沖液（82+18）；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：50 μL。

2 結果與分析

2.1 凈化優化與提取選擇

水產品中主要以蛋白質脂肪為主，脂肪含量較高。孔雀石綠具有很好的親脂性，容易附著在脂肪蛋白中，難以進行目標化合分析物的提取分離凈化。實驗過程中選擇了堿性氧化鋁、酸性氧化鋁、中性氧化鋁分離樣品中的脂肪蛋白質雜質，中性氧化鋁比酸性、堿性氧化鋁對蛋白質脂肪的吸附較強。因此，前處理實驗凈化過程中，選擇中性氧化鋁固相萃取柱凈化，消除油脂蛋白質雜質的基質干擾，減少了對色譜柱和儀器的損害[5]。

此外，筆者在實驗過程中使用乙腈（C?H?N）、乙酸鈉緩沖溶液（CH?COONa）、甲醇（CH?OH）和二氯甲烷（CH?Cl2）等作為提取溶劑，結果發現目標化合物易溶于乙腈（C?H?N），且乙腈的提取效果最好，回收率為85.4%～91.8%，因此選擇乙腈作為提取劑，結果見表1。

表1 不同提取劑的效果情況表

2.2 流動相的選擇

實驗研究了乙酸鈉水溶液-乙腈、乙酸銨水溶液-乙腈、四丁基溴化鈉-乙腈等不同流動相對無色孔雀石綠（Leucomalachite Green，LMG）的分離效果。結果表明，以乙酸銨水溶液-乙腈作為流動相時可獲得更好的分離效果和響應信號，從而得到好的回收率。具體數據見表2。

表2 不同流動相的效果情況表

2.3 標準曲線范圍及檢出限測定

配 制 質 量 濃 度 為 0 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和 20.0 ng·mL-1無色孔雀石綠LMG標準溶液梯度，按照1.4～1.6方法進行測定。得到無色孔雀石綠濃度y（ng·L-1）與峰面積x的線性關系方程為y=0.315 7x+0.032 25，r2=0.999 98，表明無色孔雀石綠的線性關系良好。在蟹苗空白樣品中加標濃度進行測定，由儀器給出信噪比（S/N）=3求得檢測限為0.5 μg·kg-1，以出信噪比（S/N）=10 求得定量限為 1.6 μg·kg-1。

2.4 方法回收率和精密度

用陰性蟹苗樣品作為基質，分別選擇兩種加標濃度 2 μg·kg-1和 10 μg·kg-1進行回收率和精密度實驗，無色孔雀石綠LMG回收率為78.9%～101.0%，相對標準偏差RSD＜10.0%，具體結果見表3。表明該方法操作穩定、重復性好。

表3 回收率和精密度結果表

2.5 實際樣品測定

采用本方法對本地區育苗廠的蟹苗共20份樣品進行檢測，均未檢出無色孔雀石綠藥物，相關部門應繼續加強監測，保障水產品的質量安全。

3 結論

本文通過對提取溶劑的選擇、凈化方式和流動相的選擇等建立了一種測定蟹苗孔雀石綠、無色孔雀石綠物質殘留的超高效液相色譜檢測方法，結果表明該方法具有更好的穩定性、靈敏度、方法精密度高，無色孔雀石綠的回收率為78.9%～101.0%。