葆青顆粒對卵巢儲備功能下降模型大鼠性激素水平和Bax、Bcl-2、VEGF的影響*

林光耀，張米佳，葉 濤，聶 紅，甯海燕，王永周

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

卵巢儲備功能下降(diminished ovarian reserve,DOR)指卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞質(zhì)量和(或)數(shù)量下降，并伴有血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)升高和抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)降低，是導(dǎo)致女性生育能力下降和尋求輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technologies,ART)助孕的重要原因[1]。近年來，DOR的發(fā)生率從19%發(fā)展到26%并呈上升趨勢[2，3]，但DOR的發(fā)病機理至今尚不明確。

目前西醫(yī)對DOR的治療主要包括口服雌孕激素類藥物、脫氫表雄酮、生長激素和接受ART等方式，以調(diào)整月經(jīng)周期和改善妊娠結(jié)局。但長期使用激素類藥物大大增加了患乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、腦卒中、卵巢癌等風(fēng)險，同時較多的禁忌癥也限制了激素類藥物的應(yīng)用[5-7]。因此，尋找治療DOR療效顯著且更安全的方法，成為目前亟須解決的問題。中醫(yī)治療DOR具有多靶點、多途徑和適應(yīng)證廣等獨特優(yōu)勢[8]。前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，葆青顆粒能明顯改善絕經(jīng)前女性性激素水平，在治療由激素變化引起的潮熱、失眠和眩暈等方面效果更是優(yōu)于雌激素且無不良反應(yīng)，提示其對卵巢功能有保護(hù)作用[9，10]。本實驗擬通過觀察葆青顆粒對DOR模型大鼠性激素水平和Bax、Bcl-2、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)的影響，探討葆青顆粒治療DOR的作用與機制。本研究通過西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(批號2020767)。

1 材料

1.1 動物

清潔級10～12周齡雌性SD大鼠50只，體質(zhì)量(250±10)g，由西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，動物許可證號SCXK(川)2018-17。所有動物自由飲水及攝食不含雌激素類飼料，室溫保持在23～24 ℃，濕度保持在40%～60%，自然晝夜交替，每2～3 d更換墊料1次。所有大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后連續(xù)2周行陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查。

1.2 藥物

葆青顆粒由熟地黃、山藥、山茱萸、菟絲子、枸杞子、五味子、肉蓯蓉、龍骨組成，由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室生產(chǎn)(批號XZ20000050)。

1.3 主要試劑

注射用環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX，批號H32020857)、戊酸雌二醇片(商品名：補佳樂，批號J20171038)，西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院；瑞氏-姬姆薩復(fù)合染液(型號G1020)，北京Solarbio科技有限公司；大鼠FSH試劑盒(型號34438)、黃體生成素(Luteinizing hormone,LH)試劑盒(型號30447)、雌二醇(estradiol,E2)試劑盒(型號30267)、AMH試劑盒(型號30630)和VEGF試劑盒(型號30908)，睿信生物科技有限公司；重組Anti-Bax抗體(貨號ab32503)，美國Abcam公司；Bcl-2抗體(貨號AF6139)，中國Affinity公司；VEGF抗體(貨號19003-1-AP)，美國Proteintech公司。

2 方法

2.1 模型制備

將10～12周齡雌性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，連續(xù)2周每日定時使用瑞氏-吉姆薩復(fù)合染液對所有大鼠行陰道脫落細(xì)胞觀察。圖1示，大鼠正常動情周期有以下特點：動情前期有核上皮細(xì)胞夾雜無核角化細(xì)胞；動情期大量無核角化細(xì)胞形態(tài)欠規(guī)則；動情后期有核上皮細(xì)胞、白細(xì)胞和無核角化細(xì)胞可同時被觀察到；動情間期大量白細(xì)胞，偶見有核上皮細(xì)胞。篩選出正常動情周期的50只大鼠，隨機選取10只納入正常組，余40大鼠一次性腹腔注射CTX 75 mg/kg誘導(dǎo)DOR模型[11]，正常組大鼠注射相同劑量0.9%氯化鈉溶液。隨后2周每日定時對造模組大鼠行陰道脫落細(xì)胞學(xué)觀察，大鼠正常動情周期為4～5 d，若動情周期發(fā)生紊亂，并以動情周期延長為主要表現(xiàn)，則提示造模成功[12]。

注：A.動情前期；B.動情期；C.動情后期；D.動情間期圖1 大鼠正常動情周期陰道脫落細(xì)胞觀察(瑞氏-吉姆薩染色 ×100)

2.2 分組及給藥

將38只成模大鼠(造模過程中意外死亡2只大鼠)按隨機數(shù)字表法分為模型組、補佳樂組、葆青顆粒高劑量組(葆青高劑量組)和葆青顆粒低劑量組(葆青低劑量組)，模型組和葆青低劑量組各9只大鼠，余各組均納入10只大鼠。葆青高、低劑量組大鼠連續(xù)3周每日定時灌胃葆青顆粒9 g/kg、3 g/kg，補佳樂組大鼠灌胃戊酸雌二醇片(0.21 mg/kg)，正常組和模型組大鼠均灌胃相同容積，0.9%氯化鈉溶液。

2.3 取材及指標(biāo)檢測

末次給藥后所有大鼠均禁食禁飲12 h，水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，收集上清-80 ℃?zhèn)錂z；萬分位電子天平稱重大鼠雙側(cè)卵巢組織，結(jié)果保留3位小數(shù)；左側(cè)卵巢組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，4 ℃?zhèn)錂z；右側(cè)卵巢組織勻漿后-80 ℃?zhèn)錂z。

2.3.1 一般情況 觀察并記錄大鼠大小便情況、精神狀態(tài)與皮毛疏密程度。卵巢指數(shù)=雙側(cè)卵巢(mg)/大鼠體質(zhì)量(g)×100%。

2.3.2 卵巢組織病理學(xué)觀察 取出固定液中的卵巢組織，石蠟包埋、切片、HE染色，封片后在光鏡下觀察卵泡、黃體及顆粒細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)變化。

2.3.3 血清FSH、LH、AMH、E2和卵巢組織VEGF水平檢測 ELISA檢測血清FSH、AMH、LH、E2和卵巢組織VEGF水平。以上操作均按照試劑說明書步驟進(jìn)行。

2.3.4 卵巢組織中Bax、Bcl-2、VEGF蛋白表達(dá) 使用免疫組化法測定各組大鼠卵巢組織中Bax、Bcl-2、VEGF蛋白表達(dá)。取上述完成石蠟包埋的卵巢組織切片、脫水，消除過氧化物酶活性，一抗(濃度分別為1∶100、1∶100和1∶200)孵育過夜，二抗孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、封片，光鏡下觀察并選取卵泡數(shù)量較多的區(qū)域拍片。運用Image J圖像處理軟件，計算每張圖片的光密度值。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠行為學(xué)觀察

模型組和補佳樂組于灌胃第1周內(nèi)分別意外死亡1只和2只大鼠。與正常組比較，模型組大鼠精神差，對外界刺激反應(yīng)較遲緩，進(jìn)食與飲水量減少，部分大鼠出現(xiàn)脫毛、大便稀溏或干燥、尿血。與模型組比較，各藥物干預(yù)組大鼠精神狀態(tài)佳，對外界刺激反應(yīng)靈敏，進(jìn)食與飲水量未見明顯改變，毛色光滑，大小便未見異常。

3.2 各組大鼠卵巢濕重和卵巢指數(shù)比較

表1示，與正常組比較，模型組大鼠卵巢濕重和卵巢指數(shù)顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，各治療組卵巢濕重和卵巢指數(shù)均增高(P<0.05)。

表1 各組大鼠卵巢濕重與卵巢指數(shù)比較

3.3 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察

圖2示，與正常組比較，模型組卵巢組織中發(fā)育卵泡和顆粒細(xì)胞層較少，閉鎖卵泡數(shù)較多，未見優(yōu)勢卵泡發(fā)育；與模型組比較，各治療組卵巢組織中均可見各級卵泡及黃體，卵泡形態(tài)規(guī)則，顆粒細(xì)胞層及卵泡液含量豐富。

注：A.正常組；B.模型組；C.補佳樂組；D.葆青高劑量組；E.葆青低劑量組圖2 大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察(HE ×100)

3.4 各組大鼠血清FSH、LH、AMH、E2和卵巢組織VEGF水平比較

因正常組大鼠麻醉死亡3只，未收集到血液標(biāo)本，故總采集血清標(biāo)本42件。表2示，與正常組比較，模型組大鼠FSH和LH水平升高，AMH、E2和VEGF水平下降(P<0.05)。與模型組比較，各治療組表現(xiàn)為FSH、LH水平下降和AMH、E2、VEGF水平升高(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清FSH、LH、AMH、E2和卵巢組織VEGF水平比較

3.5 免疫組化法測定各組大鼠卵巢組織中Bax、Bcl-2、VEGF表達(dá)結(jié)果

圖3表3示，Bax、Bcl-2、VEGF均表達(dá)于卵巢顆粒細(xì)胞、各級卵泡和黃體細(xì)胞中。與正常組比較，模型組中Bax蛋白表達(dá)增強，Bcl-2和VEGF蛋白表達(dá)減弱(P<0.05)；與模型組比較，各治療組Bax蛋白表達(dá)減弱，Bcl-2和VEGF蛋白表達(dá)增強(P<0.05)。

注：A.正常組；B.模型組；C.補佳樂組；D.葆青高劑量組；E.葆青低劑量組圖3 大鼠卵巢組織Bax、Bcl-2、VEGF免疫組化染色圖(×400)

表3 免疫組化法測定各組大鼠卵巢組織Bax、Bcl-2、VEGF表達(dá)結(jié)果比較

4 討論

現(xiàn)國內(nèi)外對DOR的診斷尚缺乏特異性指標(biāo)和統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[1]，故在臨床診療中需結(jié)合患者年齡、臨床表現(xiàn)及性激素水平做出綜合判斷[13]，如基礎(chǔ)FSH>6.5 mIU/mL、竇卵泡計數(shù)<12或AMH<1.0 ng/mL，則提示卵巢儲備功能開始下降。其中AMH分泌具有不受月經(jīng)周期和外源性類固醇干擾等優(yōu)勢，其敏感性高于基礎(chǔ)FSH，能較早地反映卵巢儲備功能水平[14]。本研究模型組大鼠在注射CTX后出現(xiàn)血清FSH和LH水平升高，E2和AMH水平降低，卵泡和黃體數(shù)量明顯減少，剩余卵泡趨于閉鎖，提示采用一次性腹腔注射CTX 75 mg/kg方法誘導(dǎo)DOR模型成功，與文獻(xiàn)報道一致[12]。

DOR的發(fā)病機制尚未被完全闡明。目前諸多研究表明，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白與DOR疾病的發(fā)生關(guān)系密切，其中Bax和Bcl蛋白對卵泡形成和閉鎖的作用機制更是當(dāng)前的研究熱點[4]。隨著對Bcl蛋白作用機制的深入探索，現(xiàn)根據(jù)其對細(xì)胞作用的不同被分為2個亞家族，首先是抗凋亡蛋白家族，包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1和 A1；其次是促凋亡蛋白家族，包括Bax、Bak和Bok；其中Bax基因所編碼的BCL2L4蛋白在激活后與Bcl-2蛋白形成異源二聚體，通過改變線粒體外膜通透性，誘導(dǎo)線粒體腫脹、破裂，促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素C釋放，同時激活半胱氨酸天冬蛋白酶(caspases)，啟動細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15-17]。而Bcl-2通過抑制Bax釋放細(xì)胞色素C，以阻斷下游相關(guān)凋亡蛋白酶激活。因此在卵泡發(fā)育過程中，Bcl-2高表達(dá)可抑制卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中caspases活性，減少卵泡凋亡，而高Bax和/或低Bcl-2表達(dá)以及二者高比值則促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡[18-20]。此外，手術(shù)對卵巢血供以及周圍組織正常解剖結(jié)構(gòu)的損傷造成卵巢新生血管減少，導(dǎo)致卵泡生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，最終使卵泡中VEGF水平降低，閉鎖卵泡數(shù)量增加，卵巢儲備功能逐漸下降[21]。葆青顆粒的前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，諸多患者于婦科手術(shù)后和圍絕經(jīng)期出現(xiàn)潮熱、月經(jīng)紊亂以及性激素水平改變等一系列卵巢儲備功能下降的臨床表現(xiàn)，通過服用葆青顆粒后以上癥狀均有顯著改善[9，10]。本實驗結(jié)果顯示，DOR模型組大鼠表現(xiàn)出FSH和LH水平升高，E2、AMH和VEGF水平下降，Bax蛋白表達(dá)增強及Bcl-2蛋白表達(dá)減弱。故推測Bax與Bcl-2水平比例失衡和VEGF表達(dá)降低導(dǎo)致卵泡生成和發(fā)育障礙，從而影響了血清激素水平的變化。

中醫(yī)學(xué)雖無對DOR病名的記載，但其臨床表現(xiàn)屬于中醫(yī)學(xué)“血枯”“年未老經(jīng)水?dāng)唷薄伴]經(jīng)”和“不孕”等范疇[22]。《傅青主女科》載：“經(jīng)水早斷，似乎腎水衰涸”，認(rèn)為腎乃先天之本，主藏精，精足化血，精虧血少，血海難溢，故經(jīng)水早斷；《婦人大全良方》中指出，經(jīng)水由心血所化，腎氣充盛，沖任通利，經(jīng)血滿盈，月經(jīng)宣和，然血虛經(jīng)枯無以滋養(yǎng)，經(jīng)則難行也，故滋腎填精、養(yǎng)陰益血為其主要治法。葆青顆粒重用熟地黃補腎填精養(yǎng)血為君藥；山藥、山茱萸、菟絲子、枸杞子補肝腎、益精血，并增強熟地黃滋陰補血之力，以上4藥合為臣藥；佐以溫補之品肉蓯蓉，以契“陽中求陰”之妙；協(xié)五味子和龍骨補腎寧心，心腎相交，水火既濟，針對DOR患者“腎水衰涸”表現(xiàn)恰好藥證相符。同時，該方中大部分藥物具有直接作用于細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的作用，如梓醇作為熟地黃提取物，可通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2比值參與細(xì)胞凋亡過程[23]；山藥的主要成分薯蕷皂苷元除具備以上作用外，還能作用于VEGF調(diào)節(jié)血管生成[24]；菟絲子和枸杞子具有抑制卵巢細(xì)胞凋亡、改善性激素水平等功效[25，26]。這也是葆青顆粒應(yīng)用于DOR的現(xiàn)代藥理學(xué)機制。

綜上所述，葆青顆粒可通過降低卵巢組織中Bax蛋白表達(dá)，增強Bcl-2和VEGF蛋白表達(dá)，從而改善DOR模型大鼠性激素水平，還可通過減少卵巢內(nèi)卵泡閉鎖，增加顆粒細(xì)胞層及卵泡液含量起到治療DOR的作用。