乳香醋炙前后對血瘀模型大鼠改善作用的對比研究*

張琳琳，劉振麗，王 淳，彭詩濤，寧張弛△，宋志前△

(1.浙江省食品藥品檢驗研究院，杭州 310052；2.國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室， 杭州 310052；3.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700)

乳香為橄欖科植物乳香樹BoswelliacarteriiBirdw.及同屬植物Boswelliabhaw-dajianaBirdw，樹皮滲出的樹脂具有活血定痛、消腫生肌的功效，主治胸痹心痛、產后瘀阻、跌打損傷和風濕痹痛等血瘀證[1]。乳香始載于《名醫別錄》，后《本草綱目》《證類本草》均有記載并沿用至今[2]。現代藥理學研究表明，乳香具有抗腫瘤、抗炎、止痛、調節免疫等作用[3-7]。中醫認為炮制輔料醋入肝經，具有活血行氣、散瘀解毒、開胃養肝等功效[8]。乳香醋炙后能增強活血化瘀、消腫止痛功效，并能降低其刺激性，因此中醫臨床常用乳香的炮制品醋乳香飲片入藥[9]。

由瘀血內阻而引起的病證，中醫稱為血瘀證[10]，可涉及現代醫學的腫瘤、冠心病、腦梗死、免疫性疾病等多種疾病。已有研究證明，乳香具有較好的活血化瘀作用，但其醋炙前后對血瘀證模型動物的作用差異研究較少。

本研究擬從體內體外兩方面評價乳香醋炙前后對大鼠血瘀模型的改善作用。體外實驗采用二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)為誘導劑，比較乳香和醋乳香對大鼠體外全血血小板聚集的影響。體內活血作用擬采用大鼠寒凝血瘀模型，以血液流變指標和凝血因子指標比較乳香和醋乳香的體內活血作用。通過探討乳香醋炙前后體內外活血作用的藥效學差異，以期闡明乳香醋炙的科學性和合理性。本研究通過中國中醫科學院中醫基礎理論研究所實驗動物福利倫理審查委員會批準(批準號2020-066)。

1 材料

1.1 動物

采用清潔級SD雄性大鼠，體質量(280±10)g，購于中國食品藥品檢定研究所，實驗動物許可證號SYXK(京)2017-0005。飼養于中國中醫科學院中醫基礎理論研究所清潔級動物房，環境溫度(25±2)℃，相對濕度50%～70%，常規適應性飼養1周后開始實驗。

1.2 藥物

乳香購于北京同仁堂藥店(批號805270216)，經北京中醫藥大學中藥學院劉春生教授鑒定為橄欖科植物乳香樹BoswelliacarteriiBirdw.樹皮滲出的樹脂；阿司匹林腸溶片，拜耳醫藥保健有限公司，批號BJ16287；鹽酸腎上腺素注射液，天津金耀氨基酸有限公司，批號1312151。

1.3 主要試劑及儀器

ADP(批號212010319)，北京博奧拓達科技有限公司；異氟烷(批號19021501)，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；凝血酶原時間(prothrombin time，PT)測定試劑盒(批號STY20301-49)、凝血酶時間(thrombin time，TT)測定試劑盒(批號STY20101-75B)、纖維蛋白原(fibrinogen，FIB)測定試劑盒(批號STY20401-57)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)試劑盒(批號STY20201-46)，北京中勤世帝科學儀器有限公司；肝素真空采血管(批號20190801)、枸櫞酸鈉真空采血管(批號20190701)，江蘇宇力醫療器械有限公司。

LD5-10低速臺式離心機(北京瑞邦興業科技有限公司)；590 Whole-Blood aggregometer全血血小板聚集儀(Chrono-LOG公司)；LG-Paber-Ⅱ全自動凝血因子分析儀(北京世帝科學儀器)；BT-300全自動血液流變儀(北京博萊特通科技有限公司)。

2 方法

2.1 乳香、醋乳香混懸液的配制

根據課題組前期研究結果[11]和2020版《中華人民共和國藥典》[1]制備醋乳香。稱取乳香適量置炒鍋中，采用中火炒制9 min后表面微溶，按照10∶1比例噴淋米醋，繼續翻炒，約11 min后觀察到表面呈油亮光澤時迅速取出，將炒制好的醋乳香轉移至托盤中，攤放晾涼備用。

取等量的乳香和醋乳香，相同條件下粉碎，過100目篩。按照70 kg人體用藥劑量，用0.5%羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na)溶液制成濃度為86.4 g/L的乳香和醋乳香混懸液，4 ℃儲存備用。用時室溫放置60 min，振搖使其混勻。

2.2 體外全血血小板聚集試驗

2.2.1 ADP溶液的配制 取ADP適量精密稱定，加0.9%氯化鈉溶液制成每1 mL含0.4 mg ADP的溶液。

2.2.2 大鼠麻醉和取血 取6只正常大鼠以異氟烷呼吸麻醉，待大鼠麻醉成功后腹主動脈取血，置于肝素鈉抗凝管中待測。

2.2.3 供試品溶液制備 取乳香和醋乳香粉末3 g，加25倍95%乙醇超聲30 min提取2次，過濾并合并濾液，減壓干燥，殘渣用20 mL 2%氫氧化鉀溶解即得。取阿司匹林片粉碎，稱取10 mg于10 mL 2%氫氧化鉀溶解即得。

2.2.4 全血血小板聚集測定 測定全血血小板聚合值常用的方法有比濁法和電阻法[12]。本實驗采用電阻法，以2%氫氧化鉀為空白對照組、阿司匹林為陽性對照組，通過比較乳香、醋乳香提取物對ADP誘導正常大鼠全血血小板聚集的聚合值以及電阻變化斜率，考察乳香醋炙前后對體外全血血小板聚集的影響。具體方法為：5個反應杯中均放入磁棒，置于預溫孔(37 ℃)預溫10 min，依次加入0.9%氯化鈉溶液500 μL、肝素鈉抗凝全血500 μL后，陽性對照組及乳香、醋乳香組分別加入阿司匹林、乳香和醋乳香供試品溶液10 μL，空白對照組加入2%氫氧化鉀10 μL。將反應杯放入反應孔中，反應5 min插入檢測電極，待基線平穩2 min后，加入10 μL ADP溶液于反應體系中，記錄電阻的變化曲線，測定并比較各組血小板聚合值及電阻變化曲線斜率。

2.3 體內活血實驗

2.3.1 寒凝血瘀證大鼠模型 采用注射腎上腺素和冰水浴刺激的方法建立寒凝血瘀證動物模型[13]。大鼠皮下注射鹽酸腎上腺素(0.8 mg/kg)，2 h后置于4 ℃冰水中游泳3.5 min，用毛巾擦拭，吹風機吹干，等待2 h后再皮下注射等劑量的鹽酸腎上腺素，末次給藥后禁食12 h后采血。

2.3.2 動物分組及給藥方法 將模型動物分為模型組、乳香組(0.90 g/kg)、醋乳香組(0.90 g/kg)、陽性藥組(54 mg/kg)4組各6只。正常組與模型組灌胃給予0.5% CMC-Na溶液，給藥組按上述劑量分別灌胃給藥，每天給藥1次，連續給藥2周。

2.3.3 血液流變學指標檢測 末次給藥后禁食12 h。各組大鼠吸入異氟烷麻醉，經腹主動脈取血后置于肝素鈉采血管，用于全血黏度、血沉及紅細胞壓積的檢測。另取抗凝血液1 mL，離心后取血漿測定血漿黏度。

2.3.4 凝血因子指標檢測 腹主動脈取血，置于3.2 %枸櫞酸鈉抗凝管(1∶9)中，離心后取血漿，檢測PT、APTT、TT、FIB、血沉及紅細胞壓積水平。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 乳香醋炙前后對ADP誘導全血血小板聚集作用

采用ADP誘導大鼠全血血小板聚集試驗，比較醋乳香和乳香體外活血活性(見圖1)。與對照組比較，阿司匹林組、醋乳香組和乳香組的血小板聚合值和斜率均顯著下降(P<0.05，P<0.01)，且醋乳香組血小板聚合值和斜率低于乳香組。結果表明，醋乳香較乳香能夠更好地抑制ADP誘導的全血血小板聚合值及斜率。

注：A.血小板聚合值；B.斜率；與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01圖1 乳香醋炙前后對ADP誘導的全血血小板聚集試驗結果

3.2 乳香醋炙前后對寒凝血瘀模型大鼠血液流變學指標的作用

以寒凝血瘀模型對比醋乳香和乳香對體內血液流變學的影響(結果見表1)。與正常組比較，模型組5個切變率下的全血黏度、血漿黏度、血沉以及紅細胞壓積均顯著提升(P<0.05，P<0.01)，表明模型制備成功。與模型組比較，醋乳香組和陽性藥組切變率1(1/s)的全血黏度、血漿黏度及紅細胞壓積均顯著下降(P<0.05或P<0.01)，而乳香組僅有紅細胞壓積明顯下降(P<0.05)。結果表明，在改善寒凝血瘀模型大鼠血液流變學方面，醋乳香的作用優于乳香。

表1 乳香和醋乳香對大鼠血液流變學的影響

3.3 乳香醋炙前后對寒凝血瘀模型大鼠凝血因子的作用

比較醋乳香和乳香對寒凝血瘀模型大鼠凝血因子的影響(見表2)。與正常組比較，模型組TT和PT值顯著降低，FIB值顯著升高(P<0.05，P<0.01)，表明寒凝血瘀模型造模成功。與模型組比較，陽性藥組以及醋乳香組的TT和PT值顯著升高，FIB值顯著降低(P<0.01)；乳香組僅TT值明顯上升(P<0.01)。結果表明，醋乳香比乳香抑制寒凝血瘀模型大鼠凝血功能效果更好。

表2 乳香醋炙前后對寒凝血瘀模型大鼠凝血因子的影響

4 討論

《素問·調經論篇》：“血氣者，喜溫而惡寒，寒則泣不能流，溫則消而去之。”《靈樞》：“寒邪客于經絡之中，則血泣，血泣則不通。”中醫認為“寒氣入經而稽遲，泣而不行”，即寒邪使血脈運行不暢而致寒凝血瘀，以及形成“惡血”與“留血”等[10]。血液流變學主要是通過檢測血液黏度和凝集、紅細胞的聚集以及全血血小板的聚集等指標來研究血液的流動性及變形性規律[14]。血液流變學異常主要表現為血流速減慢、黏度增高，呈“黏、濃、凝、稠、聚”狀態。凝血因子是評價機體血液凝血功能的重要指標，PT反映血漿中凝血因子X、Ⅶ、Ⅱ、V和I水平，APTT反映血漿中凝血因子Ⅺ、Ⅸ和Ⅷ水平，TT反映血液中凝血因子的抗凝劑是否增加。FIB是一種具有凝血功能的蛋白質，可促使紅細胞聚集[15，16]。血瘀證的表現與血液流變學及凝血功能異常頗為一致，故臨床常將血液流變學和凝血因子作為評價血瘀證的重要指標。本研究采用冰浴應激加腎上腺素方法，模擬寒凝血瘀證的病理過程制備動物模型。基于凝血因子和血液流變學指標評價乳香醋炙前后對寒凝血瘀證大鼠干預作用的差異，結果表明醋乳香改善寒凝血瘀大鼠血液流變學和抗凝血的作用更強。此外，ADP是一種血小板釋放的自體凝血物質，其通過血小板膜的ADP受體誘導血小板聚集。研究借助ADP誘導血小板聚集的體外實驗，比較乳香醋炙前后的解聚作用，結果表明醋乳香對ADP誘導的全血血小板聚集的抑制作用更強，可見乳香醋炙對活血活性的增效作用可能與血液中血小板的ADP受體有關。

血瘀證作為臨床重要證型之一，現代醫學認為與血液流變學異常、微循環障礙、免疫性炎癥反應以及結締組織代謝異常等病理變化有關，而血管內皮細胞變化是病變的中心環節[17]。現代藥理學研究表明，乳香可以降低炎性因子白細胞介素(interleukin，IL)-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α的分泌，從而改善血管內皮細胞功能障礙[18]。乳香提取物對微血管內皮細胞的抗炎作用是基于其系統調控TNF-α誘導基因變化而發揮的，如基質金屬蛋白酶(matrix metallopeptidase，MMP)-3、MMP-10和MMP-12[19]。最新1項研究成果證實，乳香對于糖尿病微血管病變、糖尿病足也有一定的改善作用，其可以通過抑制氧化炎癥標志物表達，促進膠原合成，加快愈合速度，顯著減少傷口細胞壞死程度[20]。

藥效作用的產生與物質基礎密切相關。課題組前期對炮制輔料醋和乳香化學成分開展了相關研究。研究發現，炮制輔料醋中具有活血止痛作用的川芎嗪、四氫哈爾滿堿、麥角胺等活性成分，這些成分是乳香醋炙后活血止痛作用增強的重要物質基礎[21]。乳香最主要的活性物質是三萜類的乳香酸成分[22，23]，主要包括11-羰基-β-乳香酸(11-keto-β-boswellic acid，KBA)和3-乙酰-11-羰基-β-乳香酸(3-acetyl-11-keto-β-boswellic acid，AKBA)、乙酰-β-乳香酸(acetyl-β-boswellic acid，β-ABA)、β-乳香酸(β-boswellic acid，β-BA)等[24，25]。乳香中的主要乳香酸成分AKBA可以通過介導核因子(nuclear factor，NF)-κB通路發揮抗動脈粥樣硬化的作用[26]，β-BA可以刺激內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的釋放，從而改善血瘀引發的內皮功能紊亂[27]。乳香的水提取液通過抑制p38 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen0activated protein kinase，MAPK)和熱休克蛋白(heat shock proteins，Hsp)27通路，削弱血小板源生長因子對主動脈平滑肌細胞的增殖和遷移作用[28]。課題組前期研究結果顯示，乳香醋炙后AKBA與β-BA的含量大大提升，同時還發現具有9,11-去氫結構的乳香酸成分在醋炙后含量增加10.8倍。而體外初步的抗炎篩選結果也表明，該類成分的抗炎活性與AKBA和β-BA類似[29]，這可能也是乳香醋炙后改善血管內皮細胞功能障礙和動脈粥樣硬化作用增強的原因。

分子生物網絡系統進一步揭示乳香醋炙前后差異化學成分藥理作用和作用機制，結果顯示[29]炎癥反應是血管的初級反應，乳香醋炙前后可能通過介導血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor-A，VEGFA)、MMP-9、TNF、IL-1β、轉錄后基因沉默(post-transcriptional gene silenceing，PTGS)等炎癥相關靶點增效對血管炎癥的干預效果，其中VEGFA可促進新生血管形成，增加血管通透性[30]，而MMP-9與創面愈合及血管新生過程高度相關[31]。TNF和IL-1β是血管病變出現引發核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體活化等細胞焦亡過程中的作用靶點[32]。網絡藥理學預測結果顯示[29]，乳香醋炙后作用增強的通路如晚期糖基化終產物及其受體(advanced glycation end products and their receptors，AGE-RAGE)信號通路、NF-κB信號通路等均與血管病變的改善作用密切相關，而研究表明抑制和阻斷二者能夠增加VEGF、一氧化氮等因子分泌，從而促進血管新生[30]。

中醫理論認為，氣、血、津液的運化失調是導致血管病變的本質原因，其病理產物痰、瘀、濁、毒在血脈中的蓄積則是關鍵的致病因素[33，34]。乳香味辛性散，具有走竄的特性，其既行氣分又入血分，內至臟腑宣通氣血，外至經絡通達瘀滯[35]，而乳香醋炙后可以增強其活血化瘀的作用特點。故本實驗開展乳香和醋乳香的藥效對比研究，為擴展傳統中藥炮制的臨床應用、推動中醫藥現代化進程、揭示傳統中藥炮制理論的科學內涵提供參考。