山蠟梅葉提取物的抗炎鎮痛藥效學研究

萬春云，張俊明，雷旭華，朱良輝，李玉云

1.江西省醫療器械檢測中心，江西 南昌 330000；2.江西佑美制藥有限公司，江西 上饒 333200

山蠟梅Chimonanthun nitensOliv.為我國特有的蠟梅科蠟梅屬植物，收載于《中國藥典》（1977 年版），主要分布于江西、安徽等地。山蠟梅藥用部位為其干燥葉，其中含有豐富的揮發油、總黃酮、生物堿、香豆素等成分，可以泡茶飲用，民間常用于治療感冒咳嗽。藥理研究表明，山蠟梅葉具有清涼消暑、降脂降壓的作用［1］。同時有研究表明，山蠟梅葉提取物在鎮咳、祛痰、鎮痛以及預防心腦血管疾病方面均有一定的藥理作用，且能明顯改善由感冒等引起的一系列臨床癥狀［2］，山蠟梅葉揮發油和濃縮水提液對金黃色葡萄球菌和流感病毒有較強的抑制作用［3］，山蠟梅感冒茶能顯著降低由醋酸引起的腹腔毛細血管的通透性、抑制蛋清所致大鼠腳腫，有較強的炎癥抑制作用［4］。然而山蠟梅葉發揮抗炎鎮痛活性的有效部位以及物質基礎尚不清楚。本實驗參照2015 年版《中國藥典》四部中揮發油測定法（甲法），蒸餾提取揮發油［5］，藥渣水煎醇沉后采用大孔吸附樹脂分離純化制備總黃酮，分別對30%乙醇和70%乙醇兩個提取部位的抗炎、鎮痛活性進行考察，以期初步篩選山蠟梅葉抗炎鎮痛的有效部位，為明確其物質基礎提供依據。

1 材料與儀器

1.1 藥材

山蠟梅葉藥材由江西佑美制藥有限公司提供，由朱良輝研究員鑒定為蠟梅科蠟梅屬山蠟梅Chimonanthun nitensOliv.的干燥葉。

1.2 動物

SPF 級ICR 小鼠120 只，體質量范圍18～22 g，動物合格證NO.43004700042165、NO.43004700049075，生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002，來源：湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.3 儀器

鉆石牌秒表（上海秒表廠）；德國sartorius ME超微量電子天平；德國sartorius BS224S 電子天平；打孔器（孔徑8 mm，光大試驗儀器廠）；UV2600紫外可見分光光度計（日本島津有限公司）。

1.4 試藥與試劑

阿司匹林腸溶片（拜耳醫藥保健有限公司，批號BJ38164，規格：100 mg）；布洛芬緩釋片（惠州大亞制藥股份有限公司，批號171104，規格：0.3 g）；二甲苯（上海化學試劑有限公司，批號1408242）；蘆丁標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號0080-9705）。其余試劑均為市售分析純。

2 方法與結果

2.1 揮發油的提取

取山蠟梅葉2 kg，置提取罐中，加14 倍量水，提取揮發油5 h 后收集揮發油，另器保存。揮發油提取率為2.28%。

2.2 總黃酮的提取

2.2.1總黃酮含量測定方法以蘆丁標準品作為對照，采用紫外分光光度法［NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色］在496 nm 處測定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制回歸曲線，得回歸方程為：Y=10.298 83X+0.002 05，r=0.999 2，表明總黃酮含量（以蘆丁計）在0.010 0～0.050 0 mg/mL范圍內與吸光度A 呈現良好的線性關系。

2.2.2總黃酮類成分的分離和富集取山蠟梅葉提取揮發油后的藥渣再加12 倍水煎煮提取1.5 h，濾過，濾液與揮發油提取后的水液合并，濃縮成清膏。放冷，加入等量乙醇，攪勻，靜置24 h，濾過，取水提醇沉浸膏，稀釋至藥材∶藥液=1∶1，加相同體積的乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯液無色，回收乙酸乙酯，殘渣加水溶解，以藥材∶大孔樹脂1∶10 的比例上大孔樹脂柱，分別用水，30%乙醇，50%乙醇，70%乙醇，95%乙醇洗脫，通過多次重復上述實驗，將各洗脫液真空干燥，得干浸膏，分別取適量干浸膏，按上述山蠟梅葉中總黃酮的含量測定方法測定其中黃酮的含量，測定結果見表1。

表1 不同洗脫部位中總黃酮的含量

經過多次重復試驗，對山蠟梅葉水提醇沉液中的黃酮類成分進行富集，總黃酮含量較高的兩個部位均為30%乙醇和70%乙醇兩個部位，故我們將30%乙醇和70%乙醇合并，作為總黃酮提取部位。

2.3 山蠟梅葉中不同提取物對小鼠痛覺潛伏期的影響

取合格試驗小鼠60 只，按體質量隨機分為對照組、總黃酮5 g/kg（低劑量組）及10 g/kg（高劑量組）、揮發油5 g/kg（低劑量組）及10 g/kg（高劑量組）和布洛芬緩釋片0.1 g/kg 劑量組，對照組給予動物飲用水，給藥組按相應組別給予不同的藥物，均20 mL/kg，1 次/d，連續給藥5 次，于末次給藥后1 h、2 h 將小鼠尾巴浸于水面以下3 cm，水溫（52.0±0.5）℃，小鼠受到熱刺激尾巴甩出水面，尾巴甩出水面的時間被記錄為疼痛的閾值，為了防止熱水對小鼠組織造成傷害，截止時間為10 s。

2.4 山蠟梅葉中不同提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

取合格試驗小鼠60 只，按體質量隨機分為對照組、總黃酮低劑量組及高劑量組、揮發油低劑量組及高劑量組和阿司匹林腸溶片0.25 mg/kg 劑量組，對照組給予動物飲用水，給藥組按相應組別給予不同的藥物，均給予20 mL/kg，1 次/d，連續給藥5 次，末次給藥1 h 后，將小鼠右耳涂抹二甲苯溶液20 μL，均勻涂布于各鼠右耳上、下兩面，左耳不涂作對照，30 min 后處死，用打孔器于左右耳對稱部位打下耳片，用電子天平稱取各鼠耳質量，并計算鼠耳腫脹率。

2.5 統計學方法

2.6 結果

2.6.1山蠟梅葉中不同提取物對小鼠痛覺潛伏期的影響試驗在給藥后1 h、2 h，總黃酮高劑量組、揮發油低劑量組及高劑量組小鼠痛覺潛伏期明顯增加，與對照組比較均差異有統計學意義（均P<0.05），結果見表2。

表2 山蠟梅葉不同提取物對小鼠痛覺潛伏期的影響試驗結果

2.6.2山蠟梅葉中不同提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹影響的試驗結果除揮發油高劑量組外，其余各組對二甲苯致小鼠耳腫脹均有抑制作用，其中總黃酮高劑量組、揮發油低劑量組具有明顯的抑制作用，與對照組比較，均差異有統計學意義（均P<0.05），結果見表3。

表3 山蠟梅葉不同提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響試驗結果

3 討論

山蠟梅葉中化學成分豐富，活性成分眾多，主要含有總黃酮、揮發油、生物堿類等成分［6-9］。國家醫藥管理局中草藥情報中心站編著的《植物藥有效成分手冊》一書報道，以靜脈注射的方式將山蠟梅堿注射到狗和貓的體內，發現其對麻醉貓、狗的心臟有抑制作用，血壓下降約40%［10］；2018 年袁青青等研究發現山蠟梅葉揮發油具有良好的鎮咳、平喘、祛痰、抗炎及免疫調節作用［11］，本實驗主要從鎮痛、抗炎兩方面開展山蠟梅葉藥效學研究，以研究其抗炎鎮痛作用的有效部位。山蠟梅葉尚未收錄至現行藥典，僅收錄于地方標準，《江西省中藥材標準（2014 年）》質量控制僅局限于性狀、鑒別、浸出物等［12］，作者前期對總黃酮含量測定方法進行研究，參考2015 年版《中國藥典》一部“槐米”項下總黃酮含量方法［13］和文獻方法［14］，即吸取供試品1 mL，置10 mL 量瓶中，加入甲醇4 mL，再加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，放置6 min 后，再加入10%硝酸鋁0.3 mL，放置6 min，再加入4%氫氧化鈉4 mL，加水定容至刻度，搖勻，放置15 min 后，即得。實驗發現，采用氯化鋁顯色法顯色后吸光度衰減時間很短，而硝酸鋁顯色法則相對穩定性較好，故選擇采用硝酸鋁顯色法。抗炎鎮痛實驗研究結果可以看出，山蠟梅葉總黃酮高劑量組、揮發油組高劑量組在末次給藥后1 h、2 h 小鼠痛覺潛伏期明顯增加，與對照組比較差異有統計學意義。山蠟梅葉揮發油和總黃酮對二甲苯致小鼠耳郭腫脹均有一定作用，其中總黃酮高劑量組、揮發油低劑量組具有明顯的抑制作用，與對照組比較，差異有統計學意義，需要特別指出的是，實驗結果表明，低劑量揮發油影響炎癥反應并發揮抗炎作用，但高劑量揮發油具有刺激性作用，其機制可能與前列腺素、促炎細胞因子、一氧化氮以及組胺的參與有關，需要進一步的研究來闡明這一過程。綜上所述，揮發油總黃酮類化合物是山蠟梅葉抗炎鎮痛作用的主要藥效部位。此結論為山蠟梅葉抗炎鎮痛的藥理作用的研究提供了一定的依據，但其作用機制還有待進一步研究。