柴胡皂苷B2對LPS誘導的膿毒癥肺損傷氧化應激和炎性反應的影響研究?

余莉萍 余淑菁 李旭成 崔金濤 陸佳鑫

（1.湖北省武漢市中醫醫院，湖北 武漢 430000；2.湖北省武漢市優撫醫院，湖北 武漢 430000）

膿毒癥是由于感染導致機體反應異常引發的全身炎性反應綜合征，發病過程迅速，于2017年被世界衛生組織列為全球衛生重點防治疾病［1］。膿毒癥能引發機體內多種器官的感染，如肺損傷、腦膜炎、膽管炎等，其中肺損傷是常見的并發癥，且膿毒癥急性肺損傷具有較高發病率、病死率，盡管膿毒癥急性肺損傷的相關研究已有所進展，但是病死率仍高達30%左右［2-3］。脂多糖（LPS）是細菌外膜的關鍵成分，也是誘發多種疾病的致病因素，常用來構建膿毒癥急性肺損傷模型［4］。柴胡皂苷B2是從中藥柴胡內提取的活性成分，現代藥理實驗證明具有抗炎、抗氧化、保護肝臟等多種藥理活性［5］。有研究結果顯示，柴胡皂苷B2能夠減輕LPS/氨基半乳糖誘導急性肝損傷小鼠的氧化應激和炎性損傷，改善肝臟的能量代謝［6］，但是對LPS誘導的膿毒癥急性肺損傷的研究尚不明確。本研究采用LPS誘導建立膿毒癥急性肺損傷模型，觀察柴胡皂苷B2對LPS誘導的膿毒癥急性肺損傷氧化應激損傷和炎性反應的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗清潔級SD大鼠50只，雌性各半，體質量（200±20）g，8周齡，購買中國食品藥品檢定研究院，許可證號為：SCXK（京）2012-0068。大鼠飼養于無病原菌的環境內，溫度為22～25℃，濕度為50%～65%。

1.2 試劑與儀器 LPS購于美國Sigma公司；柴胡皂苷B2購于成都曼思特生物公司，純度>99%；TUNEL試劑盒、BCA試劑盒、顯色劑購于碧云天生物；B淋巴細胞瘤（Bcl-2）抗體、Bcl-2同源二聚體X蛋白（Bax）抗體、p53抗體、β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗購于美國Abcam公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒購于南京建成生物研究所；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒、白細胞介素-1β（IL-1β）試劑盒、白細胞介素-6（IL-6）試劑盒購于Diaclone公司。

1.3 造模與分組 將大鼠隨機分為5組，每組10只，分別為空白對照組、模型組和柴胡皂苷B2低、中、高劑量組。除空白對照組外，其余大鼠腹腔注射10 mg/kg的LPS建立急性肺損傷模型。

1.4 給藥方法 造模6 h后，柴胡皂苷B2低劑量組、中劑量組、高劑量組分別腹腔注射柴胡皂苷B2藥液5、10、20 mg/kg；空白對照組和模型組注射2 mL的生理鹽水。連續給藥7 d后，采用戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠。

1.5 標本采集與檢測 1）肺組織濕干比。處死大鼠后，取出右葉肺組織，使用濾紙擦拭干凈水分，然后稱重。隨后置于70℃烘箱內24 h稱取質量，用于測定肺組織濕干比。肺組織濕干比=（濕重-干重）/干重×100%。2）TUNEL染色檢測肺組織細胞凋亡。收集大鼠部分左葉肺組織，經過石蠟包埋制成切片后，加入乙醇、二甲苯清洗，室溫下加入20 μg/mL蛋白酶K反應15 min，PBS清洗，加入內源過氧化氫酶滅活5 min，利用PBS清洗，加入Tunel試劑，加入DAB顯色液孵育10 min，利用乙醇、二甲苯脫水，用中性樹膠封片后，在光學顯微鏡下觀察Tunel染色情況，然后計算細胞凋亡率。3）Western blotting檢測肺組織Bcl-2、Bax、p53蛋白表達。收集各組部分左葉大鼠肺組織，加入蛋白裂解液進行裂解，然后提取各組的總蛋白，利用BCA試劑盒檢測定量蛋白濃度。然后將蛋白煮沸5 min，取35 μg上樣蛋白，用8%的分離膠和4%的濃縮膠處理蛋白樣品，蛋白樣品轉膜，封閉在5%脫脂奶粉內60 min，加入Bcl-2、Bax、p53、β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育60 min，加入顯色劑用于顯色、顯影。使用Quantity One軟件分析蛋白表達量。4）ELISA檢測血清SOD活性、GSH-Px活性、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6含量。處死大鼠后，收集肺組織周圍血清5 mL，4℃下2 000 r/min離心10 min，離心半徑為3 cm，并收集各組的上清液，然后按照ELISA試劑盒說明書步驟，檢測各組SOD活性、GSH-Px活性、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.6 統計學處理 應用SPSS21.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組內間比較用LSD法比較。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織濕干比及細胞凋亡率的比較 見表1。與空白對照組相比，模型組內肺組織濕干比及細胞凋亡率顯著增高（P<0.05）；與模型組相比，柴胡皂苷B2低劑量組、中劑量組、高劑量組內肺組織濕干比及細胞凋亡率顯著降低（P<0.05）；與柴胡皂苷B2低劑量組相比，柴胡皂苷B2中劑量組、高劑量組內肺組織濕干比及細胞凋亡率顯著降低（P<0.05）；與柴胡皂苷B2中劑量組相比，柴胡皂苷B2高劑量組內肺組織濕干比及細胞凋亡率顯著降低（P<0.05）。

表1 各組大鼠肺組織濕干比及細胞凋亡率比較（%，±s）

表1 各組大鼠肺組織濕干比及細胞凋亡率比較（%，±s）

注：與空白對照組比較，?P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與柴胡皂苷B2低劑量組比較，△P<0.05；與柴胡皂苷B2中劑量組比較，&P<0.05。下同。

組 別n 肺組織濕干比 細胞凋亡率空白對照組模型組柴胡皂苷B2低劑量組柴胡皂苷B2中劑量組柴胡皂苷B2高劑量組10 10 10 10 10 12.30±1.93 31.18±3.14*27.10±2.47#23.39±1.88#△16.71±1.49#△&7.21±0.67 32.46±3.43*26.78±2.72#20.33±2.18#△12.21±1.42#△&

2.2 各組大鼠肺組織細胞凋亡相關蛋白表達的比較 見圖1，表2。與空白對照組相比，模型組內Bax、p53蛋白表達顯著增加（P<0.05），Bcl-2蛋白表達顯著降低（P<0.05）。與模型組相比，柴胡皂苷B2低劑量組、中劑量組、高劑量組內Bax、p53蛋白表達顯著降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表達顯著增加（P<0.05）。與柴胡皂苷B2低劑量組相比，柴胡皂苷B2中劑量組、高劑量組內Bax、p53蛋白表達顯著降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表達顯著增加（P<0.05）。與柴胡皂苷B2中劑量組相比，柴胡皂苷B2高劑量組內Bax、p53蛋白表達顯著降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表達顯著增加（P<0.05）。

圖1 各組肺細胞凋亡相關蛋白表達

表2 各組大鼠肺組織凋亡相關蛋白表達比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織凋亡相關蛋白表達比較（±s）

組別空白對照組模型組柴胡皂苷B2低劑量組柴胡皂苷B2中劑量組柴胡皂苷B2高劑量組n 10 10 10 10 10 Bcl-2 0.67±0.06 0.31±0.03*0.39±0.04#0.46±0.04#△0.55±0.04#△&Bax 0.26±0.02 0.73±0.05*0.59±0.04#0.46±0.04#△0.37±0.03#△&p53 0.27±0.03 0.68±0.06*0.56±0.05#0.47±0.04#△0.35±0.03#△&

2.3 各組大鼠血清內氧化應激水平的比較 見表3。與空白對照組相比，模型組內SOD活性、GSH-Px活性顯著降低（P<0.05），MDA含量顯著增加（P<0.05）。與模型組相比，柴胡皂苷B2低劑量組、中劑量組、高劑量組內SOD活性、GSH-Px活性顯著增加（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.05）。與柴胡皂苷B2低劑量組相比，柴胡皂苷B2中劑量組、高劑量組內SOD活性、GSH-Px活性顯著增加（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.05）。與柴胡皂苷B2中劑量組相比，柴胡皂苷B2高劑量組內SOD活性、GSH-Px活性顯著增加（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.05）。

表3 各組大鼠SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量比較（±s）

表3 各組大鼠SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量比較（±s）

組別空白對照組模型組柴胡皂苷B2低劑量組柴胡皂苷B2中劑量組柴胡皂苷B2高劑量組n 10 10 10 10 10 SOD（U/L）131.23±12.09 67.29±5.42*75.78±6.78#92.32±8.52#△117.91±10.38#△&GSH-Px（U/L）87.31±6.60 35.43±3.19*43.52±4.06#55.43±3.81#△72.84±6.47#△&MDA（μmol/L）2.40±0.44 8.44±0.89*6.92±0.53#5.29±0.41#△3.67±0.22#△&

2.4 各組大鼠血清內炎性因子水平的比較 見表4。與空白對照組相比，模型組內TNF-α、IL-1β、IL-6顯著增加（P<0.05）；與模型組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組內TNF-α、IL-1β、IL-6顯著降低（P<0.05）；與柴胡皂苷B2低劑量組相比，柴胡皂苷B2中劑量組、高劑量組內TNF-α、IL-1β、IL-6顯著降低（P<0.05）；與柴胡皂苷B2中劑量組相比，柴胡皂苷B2高劑量組內TNF-α、IL-1β、IL-6顯著降低（P<0.05）。

表4 各組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（pg/mL，±s）

表4 各組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（pg/mL，±s）

組別空白對照組模型組柴胡皂苷B2低劑量組柴胡皂苷B2中劑量組柴胡皂苷B2高劑量組n 10 10 10 10 10 TNF-α 85.38±7.21 215.89±18.40*177.45±15.32#134.22±11.48#△95.43±8.17#△&IL-1β 65.83±4.52 149.33±14.17*115.30±10.38#95.31±8.72#△74.81±6.78#△&IL-6 52.67±4.50 125.16±11.44*105.27±9.20#88.47±7.22#△63.78±5.70#△&

3 討論

膿毒癥急性肺損傷是多種因素導致的肺臟功能異常，使肺表面的活性物質降低，出現水腫、肺膨脹不全等表現［7］。目前，關于急性肺損傷的診斷方法和治療方法相對較少，本研究通過采用LPS誘導建立膿毒癥急性肺損傷動物模型，觀察膿毒癥急性肺損傷的發病機制。已有研究報道，LPS誘導建立急性肺損傷模型后，能改變肺組織濕干比，炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6等過度釋放，增加活性氧產生和降低抗氧化物酶活性，導致肺組織產生損傷［8-9］。SOD、GSH-Px屬于抗氧化物酶，具清除機體內氧自由基的能力，可以反映氧化應激損傷程度［10］。MDA是一種脂質過氧化物，其含量的高低能夠反映氧化損傷的程度［11］。本研究結果顯示，模型組內大鼠肺組織濕干比增加，細胞凋亡率上升，凋亡相關蛋白Bax、p53蛋白表達上調，Bcl-2蛋白表達下調，SOD活性、GSH-Px活性降低，MDA含量明顯增加，炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6分泌明顯增加，這說明本研究用LPS誘導建立的膿毒癥急性肺損傷大鼠模型構建成功。

柴胡化學成分較為復雜，有皂苷類、揮發油類、多糖類和黃酮類等，其中皂苷類化合物據今已被報道的有100多種［12］。皂苷A和D是最早從柴胡內提出分離的，皂苷B2是齊墩果二烯型衍生物，現代藥理實驗證明，柴胡皂苷具有多種藥理活性，如抗炎、抗氧化、抗凋亡、保肝、調節免疫等［13-14］。有研究結果顯示，柴胡皂苷對大鼠肺組織具有保護用，能降低肺組織細胞凋亡數目，抑制IL-6、TNF-α和iNOS含量，減輕大鼠肺組織炎性浸潤和纖維化程度［15］。高子涵等［16］研究結果發現，柴胡皂苷B2能夠降低過氧化氫誘導的肝癌細胞凋亡，降低Bax蛋白表達，增加Bcl-2蛋白表達，提高肝癌細胞的抗凋亡能力。呂行直等［17］研究結果顯示，柴胡皂苷B2可以降低四氯化碳誘導小鼠急性肝損傷血清內MDA含量，增加SOD活性，提高機體的抗氧化能力。以上說明柴胡皂苷具有良好的抗氧化、抗炎和抗凋亡能力，但是關于柴胡皂苷B2對急性肺損傷的研究尚不清楚。本研究發現，給予注射不同劑量的柴胡皂苷B2后，能降低LPS誘導的膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織濕干比，減少細胞凋亡率，下調Bax、p53蛋白表達，上調Bcl-2蛋白表達，促進SOD活性、GSH-Px活性，降低MDA含量，抑制炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6分泌，說明柴胡皂苷B2能減輕LPS誘導的膿毒癥急性肺損傷。

綜上所述，柴胡皂苷B2對膿毒癥急性肺損傷具有保護作用，能減輕其氧化應激和炎性反應，減少細胞凋亡，但具體研究機制需要進一步探究。