針刀干預對中期膝骨關節炎兔軟骨下骨壓縮力學性能的影響?

王軍美 秦露雪 陳烯琳 鐘紅剛 劉 聰 尹孟庭 郭長青△

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.中國中醫科學院望京醫院，北京 100020）

膝骨關節炎（KOA）是以關節軟骨退變、軟骨下骨硬化或囊性變、滑膜病變為主要病理變化并涉及膝周軟組織病變的全關節疾病，多發于中老年人，以膝關節疼痛和功能障礙為主要臨床表現［1］。中國KOA的患病率和致殘率高，疾病負擔重，嚴重影響患者身心健康和生活質量［2］。人口老齡化的趨勢導致KOA的發病率逐年上升。既往研究多關注于軟骨層面，自RADIN等［3］首次提出軟骨下骨的厚度、硬度的改變可誘導軟骨退變后，軟骨下骨在KOA的研究中得到更多的關注。膝關節力學失衡是KOA發病的重要誘因。其中軟骨下骨力學性能的改變在OA的發病及進展中的作用不容忽視。在膝關節應力傳導中，軟骨下骨具有一定的強度以支撐軟骨，并富有一定的彈性以緩沖大部分機械應力以保護軟骨，維持膝關節的穩定［4］。異常應力下，軟骨下骨發生異常重塑導致自身生物力學性能受損，保護軟骨功能減弱，加速軟骨退變及KOA進展。將軟骨下骨作為治療KOA的新靶點，解除膝關節異常應力，通過抑制軟骨下骨重塑改善軟骨下骨力學性能來治療KOA不失為一種新思路。

針刀力學效應可以調整膝關節力學失衡，前期已經證明針刀通過“調筋”恢復關節內良性應力改善軟骨退變［5-6］，但針刀對軟骨下骨的力學性能是否有調控作用，尚未闡明。因此，本研究通過對軟骨下骨壓縮力學性能的觀察，旨在以軟骨下骨為出發點，進一步探討針刀治療KOA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康6月齡雄性新西蘭兔24只，體質量2.0～2.5 kg，由北京科宇動物養殖中心提供，生產許可證號：SCXK（京）2018-0010。于中國中醫科學院中藥研究所大實驗動物室（SPF級）分籠飼養，室溫（20±2）℃，濕度40%～60%，12 h/12 h明暗周期，標準飼料，自由攝食飲水。

1.2 試劑與儀器

戊巴比妥鈉（北京百諾威生物科技有限公司）；多聚甲醛（北京化學試劑公司）；EDTA溶液（北京化學試劑公司）；Fast green FCF、Safranine O（美國Sigma公司）；醫用壓敏膠帶（寬0.9 cm，青島海諾生物工程有限公司）；泡沫雙面膠（厚10 mm，上海得力文具有限公司）；樹脂繃帶（150 mm×1 800 mm，衡水廉潔醫療器械有限公司）；高分子繃帶（150 mm×3 600 mm，蘇州可耐特醫療科技有限公司）；一次性針刀（0.3 mm×30 mm，北京卓越華友醫療器械有限公司）；一次性無菌針灸針（0.20 mm×13 mm，環球牌，蘇州針灸用品有限公司）；韓氏穴位神經刺激儀（LH202H，北京華為產業開發公司）；電子萬能力學試驗機（WD-1，長春非金屬試驗機場）；光學顯微鏡（BX53，日本奧林巴斯公司）。

1.3 分組與造模

適應性飼養7 d后，隨機分為空白組、模型組、針刀組和電針組，每組6只。兔禁食10～16 h，由耳緣靜脈處按30 mg/kg劑量注射3%戊巴比妥鈉溶液，待兔麻醉起效后，牽拉使其左后肢膝關節處于伸直位，采用改良后的Videman法［7］固定制動制備KOA模型。第1層，壓敏膠帶整體覆蓋包裹住膝蓋，確保任何粘有兔毛的膠帶都不會脫落，將雙面泡沫膠纏繞覆蓋壓敏膠帶；第2層，在足踝部、膝關節下方和腹股溝處纏繞一層脫脂棉墊，防止樹脂繃帶與皮膚產生摩擦；第3層纏繞樹脂繃帶，從腹股溝至足踝部固定；第4層纏繞高分子繃帶，在末端貼上醫用膠紙，留出足趾觀察血供。最后再纏繞一層防啃咬繃帶，同樣用醫用膠紙固定，防止兔的啃咬破壞，共制動9周。倫理審查機構：中國中醫科學院中藥研究所，批準號：AN001-T01-2019C005。

1.4 干預方法

各組均拆除樹脂固定1周后進行干預。1）空白組：正常飼養3周，每天同干預組一樣抓取、捆綁固定。2）模型組：造模后每天同干預組一樣抓取、捆綁固定，共3周。3）針刀組：龍膽紫定位后備皮、消毒，采用0.3 mm×30 mm一次性針刀刺入兔左后肢股內、外側肌腱止點，股直肌肌腱止點，股二頭肌肌腱止點和鵝足腱囊，針刀刀刃平行于肌腱，刀體與皮膚垂直刺入，向肌腱與骨的連接方向進行松解，出刀后按壓止血，治療每周1次，共3周。4）電針組：參照《實驗針灸學》［8］取穴，采用0.20 mm×13 mm一次性無菌針灸針刺入兔左后肢曲泉、委陽、內膝眼、外膝眼并施以平補平瀉法得氣后，韓氏穴位神經刺激儀設定波形疏密波、2/100 Hz頻率、3 mA強度行電針刺激，分別連接曲泉與委陽、內膝眼與外膝眼，每次15 min，治療隔天1次，共3周。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 取材 治療結束1周后，將各組兔麻醉后致死，在無菌條件下打開膝關節腔，除去髕骨下滑膜、韌帶、半月板等，暴露關節軟骨，采用環鉆垂直于兔左下肢脛骨平臺內外側中央負重區截取直徑8 mm、高度10 mm的軟骨-軟骨下骨復合體圓柱形組織塊。

1.5.2 形態學檢測 將軟骨-軟骨下骨復合體圓柱形組織塊置于4%多聚甲醛固定72 h后，置于15%中性EDTA-2Na脫鈣兩周，再梯度脫水、石蠟包埋、作厚度為5 μm的連續切片。切片采用番紅O/固綠染色，以便觀察軟骨及軟骨下骨病理形態，參照Mankin評分標準對軟骨退變程度進行評分［9］和病理分期［10］，1～5分為早期骨關節炎，6～9分為中期骨關節炎，10～14分為晚期骨關節炎。

1.5.3 軟骨下骨壓縮力學測試 1）標本處理：將骨組織的關節軟骨以銳刀切下，直至顯露出軟骨下骨，采用低速骨鋸平行鋸切圓柱試件端面直至骨面光滑平整，在脛骨平臺負重區找準位置后，采用金剛石環鉆取高度為3 mm、直徑為4 mm的圓柱形骨柱。2）圓柱形骨柱尺寸測試：采用精度0.01 mm的厚度儀測量圓柱形骨柱的原始高度L0。采用精度0.01 mm電子卡尺測試圓柱形骨柱的直徑d，分別在上、中、下3個水平，每個水平每隔60°測試1次，共9次取平均值，全部測量均由一名研究者完成以減少誤差，根據直徑d計算圓柱形骨柱的原始截面積S0。3）壓縮測試：采用長春非金屬試驗機場生產的WD-1材料試驗機，設定加載速度2 mm/min，傳感器量程500 N。各標本按加載位移分級測試多次，記錄初次出現屈服峰的那次測試的載荷-位移曲線，記錄最大位移ΔL、最大載荷F、其線性部分（一般取曲線上最大載荷的20%和80%的點連線）斜率k。將所得最大載荷F、標本原始截面積帶入壓縮強度σ計算公式：

將所得曲線斜率k、標本原始截面積S0、標本原始高度L0代入彈性模量E計算公式：

1.6 統計學處理

應用SPSS21.0對所得數據進行統計分析，計量資料以（±s）表示。所有數據先進行Shapiro-Wilk正態性檢驗、Levene′s test方差齊性檢驗。滿足正態分布且方差齊的數據采用單因素方差分析；否則采用Krus?kal-Wallis非參數檢驗。P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異。

2 結 果

2.1 實驗動物數量分析

實驗過程中，各組兔無死亡和感染情況，共24只兔可進入分析。

2.2 組織形態學評價

2.2.1 各組兔軟骨-軟骨下骨復合體染色光鏡結果 空白組軟骨層基質被蕃紅O染色，呈均勻紅色，結構完整、厚度正常，潮線清晰而完整，軟骨細胞規律排列，無軟骨細胞簇集現象，無血管翳生成。軟骨下骨被固綠染成藍色，軟骨下骨板厚度正常。模型組軟骨層基質淡染，軟骨層明顯變薄，軟骨細胞排列紊亂，呈現肥大增殖、簇集現象，潮線缺損，破壞甚至消失，軟骨下骨板厚度明顯增加。針刀組、電針組軟骨細胞排列較為規則，層次可分，細胞輕度增生，部分區域有簇集現象，潮線尚完整，稍有或未有血管翳生成，軟骨下骨板輕度增厚。見圖1。

圖1 各組兔膝關節蕃紅O/固綠染色圖（40倍）

2.2.2 各組兔軟骨Mankin評分 造模后，模型組Mankin評分較空白組顯著升高（P<0.01）。經針刀、電針干預后，兩組Mankin評分較模型組顯著降低（P<0.01），針刀組Mankin評分較電針組低，差異有統計學意義（P<0.01）。見表1。中期骨關節炎的Mankin評分為6～9分，模型組6個樣本的Mankin評分均在6～9分之間，符合中期骨關節炎的病理改變。

表1 各組兔關節軟骨Mankin評分比較（分，±s）

表1 各組兔關節軟骨Mankin評分比較（分，±s）

注：與空白組比較，?P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與電針組比較，#P<0.01。下同。

Mankin評分0 8.17±0.75*3.33±1.03*△△#5.17±1.17*△△組別空白組模型組針刀組電針組n6 6 6 6

2.3 軟骨下骨壓縮力學性能測試

見表2。與空白組相比，模型組兔膝關節軟骨下骨最大位移、最大載荷、壓縮強度和彈性模量顯著降低（P<0.01）。與模型組相比，針刀組膝關節軟骨下骨最大位移、最大載荷、壓縮強度、彈性模量顯著升高（P<0.01或P<0.05）；電針組膝關節軟骨下骨最大位移、最大載荷、壓縮強度和彈性模量顯著升高（P<0.05）。針刀組與電針組相比，軟骨下骨最大位移、最大載荷、壓縮強度和彈性模量上升，兩組之間差異無統計學意義（P>0.05），但針刀組趨勢更接近正常組。

表2 各組兔軟骨下骨壓縮力學性能參數比較（±s）

表2 各組兔軟骨下骨壓縮力學性能參數比較（±s）

組別空白組模型組針刀組電針組n 6 6 6 6最大位移（mm）0.22±0.01 0.18±0.01*0.21±0.01△△0.20±0.01△最大載荷（N）161.25±17.62 117.03±17.24*145.71±15.82△140.03±19.24△壓縮強度（MPa）12.51±1.07 9.57±1.40*11.52±1.11△11.22±1.21△壓縮模量（MPa）317.21±20.54 268.13±12.28*312.50±23.43△297.58±26.01△

3 討 論

膝關節力學失衡是KOA發生發展的重要誘因。本研究采用改良后的Videman法左后肢伸直位固定制動造模，能復制出因膝關節力學失衡導致的KOA模型，通過限制兔膝關節的活動，使膝周軟組織收縮，直接增加關節軟骨的壓力，膝關節應力異常，關節軟骨破壞，加速KOA的形成［10］。造模后，模型組兔膝關節番紅O/固綠染色顯示軟骨結構紊亂、破壞，出現典型病理退變，Mankin評分較空白組明顯升高。本研究在軟骨退變的基礎上，還觀察到制動造模使KOA兔膝關節軟骨層明顯變薄、軟骨下骨板明顯增厚。

軟骨下骨與軟骨在OA的發病及進展過程中互為因果。軟骨-鈣化軟骨-軟骨下骨組成的骨單元是膝關節重要的應力傳導系統，軟骨下骨富有一定的強度（承載負荷而自身不被破壞的能力）和彈性（外力作用下抵抗變形的能力），在生理負重情況下，軟骨下骨的力學功能為吸收、緩沖來自軟骨的應力，并將應力負荷向下及關節周圍組織傳遞，保護關節軟骨［11］。軟骨下骨能通過骨重塑——由破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞介導的骨形成處于動態平衡而維持了軟骨下骨骨量和結構的穩定，來不斷適應力學環境的變化。異常應力下，軟骨下骨骨吸收/骨形成失衡，表現為異常的骨重塑，通常伴有生物力學性能的下降。軟骨下骨承擔載荷和抗變形的能力下降，將減弱其緩沖震蕩的能力，可使上覆的軟骨受到異常的剪切力和張力，導致繼發性軟骨損傷和退變，在軟骨受到損傷后，又反作用于下面的軟骨下骨造成應力增加、損傷加重，最終形成一個惡性循環［12］。由此可見，軟骨下骨的生物力學性能對KOA的發生發展具有重要作用。通過抑制軟骨下骨異常重塑改善軟骨下骨力學性能，是治療KOA的潛在靶點。

壓縮試驗是測試骨組織力學性能的代表性方法之一。骨組織受力（載荷）則會變形（位移），壓縮強度代表物體在承擔負荷的情況下抵抗破壞的能力，彈性模量代表在應力作用下抵抗變形的能力。壓縮力學測試結果顯示，中期膝骨關節炎模型兔軟骨下骨最大位移、最大載荷、壓縮強度和彈性模量顯著降低，軟骨下骨的強度和彈性顯著下降，說明其力學性能受損，骨質量下降，軟骨下骨產生退變。董啟榕等［13］復制兔膝關節不穩模型發現OA的各個階段都出現軟骨下骨力學性能的異常，其硬度和強度會呈現先降低然后逐漸增高的趨勢。軟骨下骨的力學性能取決于骨量、骨質、骨小梁結構排列以及材料成分（礦物和膠原蛋白）［14］。早期軟骨下骨力學性能下降與高活性狀態的骨吸收導致軟骨下骨骨質疏松、骨小梁變薄、骨板厚度減少有關［15］。隨著疾病的發展，骨形成活躍導致骨量凈增加，軟骨下骨的骨體積增加，軟骨下骨骨小梁的形態由棒狀轉變成板狀，骨小梁厚度增加，這在影像學檢查中被視為骨硬化，軟骨下骨力學性能逐漸增高，但骨轉換率異常增高會伴隨新生的骨組織礦化不全，導致骨小梁雖然更厚但更少的情況，實際上軟骨下骨的生物力學特性減弱［12］。

KOA是一種筋骨共病、痿痹共存的疾?。?］。在發病機理方面，“經筋”先遭受病因的侵襲，“宗筋主束骨而利機關”（《素問·痿論》）的生理功能喪失累及膝“骨”，導致筋骨共病的結果。針刀作為KOA治療的有效方法之一被2020年版《膝骨關節炎中醫診療指南》推薦［1，16］。針刀治療KOA除了能有效地鎮痛、抗炎，其獨特優勢在于通過對粘連、攣縮的組織進行松解以恢復膝關節力學平衡，改善膝關節功能受限問題。其通過對膝周韌帶、肌腱及髕骨內外支持帶等進行松解，改善肌肉-肌腱生物力學特性，發揮調筋作用，通過“調筋”恢復關節內良性應力，促進軟骨細胞合成代謝，保護軟骨即發揮“治骨”作用［5-6］。經針刀、電針干預后，軟骨染色情況改善，Mankin評分顯著降低，說明針刀、電針對KOA兔軟骨損傷有保護作用，且針刀效果優于電針；軟骨下骨的最大位移、最大載荷、壓縮強度、彈性模量顯著降低，說明針刀干預可以改善軟骨下骨承擔載荷和抗變形的能力，且針刀和電針相比，針刀組的力學性能改善情況更好。其機制可能是針刀力學效應抑制了軟骨下骨異常重塑從而改善了軟骨下骨的力學性能。

綜上所述，針刀干預可改善KOA兔軟骨下骨的壓縮力學性能，從而延緩KOA進程。但本實驗仍存在不足，壓縮力學性能只能宏觀地反映軟骨下骨的骨量和骨質水平，而缺少對軟骨下骨骨量、骨質以及微觀結構變化的觀察，在今后的實驗中可進一步通過影像學的指標觀察諸如X光片、Micro-CT等，以期能更充分地、更深入地探討針刀干預KOA對軟骨下骨結構和功能的調控作用。