水生棲熱菌漆酶TaLac的性質分析及對孔雀石綠染料的脫除

毛國濤 王杰 王凱 王方園 曹樂言 張宏森 宋安東

（河南農業大學生命科學學院，鄭州 450002）

漆酶（laccase，EC 1.10.3.2）屬于藍色多銅氧化酶家族，可氧化多種酚類和非酚類化合物，同時將氧氣還原為水，無其他副產物的生成［1-2］。漆酶含有保守的組氨酸殘基，結合4個銅原子，參與底物的氧化［2-3］。由于其底物的寬泛性和綠色催化特性，漆酶被廣泛應用于紙漿的漂白、生物質的預處理、酚類污染物的降解以及合成染料的脫色和脫毒等方面［3-5］。孔雀石綠（malachite green，MG）是一種人工合成的三苯甲烷類化合物，廣泛應用于紡織品、皮革、紙張等的染色，以及魚類真菌、寄生蟲等感染的防治［6］。但MG具有致畸、致癌、致突變等毒害作用，MG的濫用和排放嚴重威脅人類健康［7］。研究表明漆酶可有效降解MG，使MG脫色，顯著降低MG對微生物、植物和動物等的毒害作用［8-10］。

漆酶廣泛存在于植物、動物、細菌和真菌中，其中細菌漆酶因其易重組表達、良好的溫度耐受性而受到越來越多的研究［3］。2006年，一個新的細菌漆酶家族DUF152被鑒定出來［11］。該家族漆酶的分子量約為30 kD，遠小于經典漆酶（60-100 kD）；且DUF152家族漆酶中不含有保守的經典漆酶銅原子結合位點［11］。但 DUF152 家族漆酶對 2，2′-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉 -6-磺酸）（2，2′-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）、2，6-二甲基苯酚（2，6-dimethylphenol，DMP）等經典漆酶底物具有催化活性［11-13］。已鑒定DUF152家族漆酶RL5、Tfu1115、LaclK均具有優異的熱穩定性，且能夠降解多種合成染料如乙基紫、堿性藍B和亞甲基藍［11-13］。DUF152家族漆酶對MG的脫色和脫毒性質仍待進一步探究。本研究通過在大腸桿菌過量表達來源于水生棲熱菌（Thermus aquaticus）的DUF152家族漆酶TaLac，利用Ni親和層析法純化得到高純度的TaLac蛋白，表征TaLac的最適pH、最適溫度等酶學性質，探究TaLac對MG脫色和脫毒的能力，為構建MG污染水體的生物修復體系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與菌株 表達載體pET-28a（+）、大腸桿菌BL21（DE3）為河南農業大學能源微生物實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 酵母提取物和胰蛋白胨購于英國OXID公司；卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-Thiogalactoside，IPTG）、NaH2PO4、Na2HPO4、咪唑、醋酸、NaNO3和三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）均購于索萊寶（北京）科技有限公司，分析純；Ni親和介質購于德國Qiagen公司；限制性內切酶Nde I和Xho I購自美國NEB公司；ABTS、DMP、愈創木酚（guaiacol）、L-多巴胺（L-dopamine，DPA）和丁香醛連氮（syringaldazine，SGZ）等購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 TaLac的生物信息學分析 用ExPASy在線服務器ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）工具分析TaLac蛋白的基本性質；利用Clustal Omega對TaLac與同源蛋白進行序列比對［14］；利用Swiss Model預測 TaLac的三級結構［15］。

1.2.2 重組表達載體pET28a-TaLac的構建 編碼TaLac（WP_003046852.1）蛋白的基因經南京金斯瑞生物科技有限公司優化后合成。以5′-AATCTCACCA TGGGCATGGTTCCGCTGCTGACC-3′和 5′-AATCTCA CTCGAGGCCGTGGCTCAGCGCCAGC-3′為引物擴增TaLac基因，利用Nco I和Xho I限制性內切酶處理后，連接至pET-28a（+），構建重組表達載體pET28a-TaLac。TaLac基因經DNA測序進行驗證。

1.2.3 TaLac的重組表達及純化 pET28a-TaLac轉化至BL21（DE3），挑取單克隆在含有25 mg/L卡那霉素的LB培養基中37℃震蕩培養至OD600為0.8時，加入0.5 mmol/L的IPTG于16℃震蕩培養12 h。離心收集菌體，使用裂解緩沖液（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.4）重懸菌體，經高壓破碎后，14 000×g離心30 min，收取上清。上清液流穿Ni親和層析柱，洗雜緩沖液（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，40 mmol/L咪唑，pH 7.4）流穿Ni親和層析柱，洗脫緩沖液（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，300 mmol/L咪唑，pH 7.4）流穿Ni親和層析柱洗脫TaLac蛋白，利用截留值為10 kD的超濾管（美國Millipore公司）進行脫鹽濃縮。通過SDS-PAGE分析TaLac的純度，利用Bradford法測TaLac的蛋白濃度，TaLac蛋白分裝凍存于超低溫冰箱。

1.2.4 TaLac酶活力的測定 采用DMP對TaLac的活力進行測定?？傮w積為0.2 mL的反應體系中含有20 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.0）、1 mmol/L CuSO4、1 mmol/L DMP和適量的TaLac，于60℃反應10 min，測定其在468 nm波長處的吸光值［ε420=148 000 L/（mol·cm）］，計算 TaLac的酶活力。1 min內氧化1 μmol 底物所需的酶量定義為1個酶活力單位（U）。

1.2.5 溫度和pH對TaLac酶活力的影響 在乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 3.0-6.0）、Tris-HCl緩沖液（pH 7.0-9.0）等緩沖液條件下，以DMP為底物，于60℃測定TaLac的酶活力，以得到的最高酶活力處的pH為TaLac的最適pH。

在乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.0）條件下，以DMP為底物，于30-80℃測定TaLac的酶活力，以得到最高酶活力處的溫度為TaLac的最適溫度。

分別將TaLac在50和60℃條件孵育一定時間后，以DMP為底物測定TaLac的殘余酶活力。以未經熱處理TaLac的酶活力為100%。

1.2.6 金屬離子對TaLac酶活力的影響 在20 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.0）中，分別添加不同濃度的CuSO4，以DMP為底物，于60℃測定TaLac的酶活力，確定Cu2+對TaLac的酶活力的影響。

在20 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.0）、1 mmol/L CuSO4緩沖液中，分別添加10 mmol/L MgCl2、CaCl2、MnCl2、ZnCl2、BaCl2和 1 mmol/L EDTA，以DMP為底物，于60℃測定TaLac的酶活力，確定不同金屬離子對TaLac的酶活力的影響。以不添加其他金屬離子和EDTA時TaLac的酶活力為對照（Ctrl）。

1.2.7 TaLac動力學參數的測定 于60℃測定TaLac在0.1-5.0 mmol/L DMP條件下的酶促反應速率，利用GraphPad Prism8軟件計算動力學參數Km和kcat。

1.2.8 TaLac的底物特異性 在20 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.0）、1 mmol/L CuSO4緩沖液條件下，于60℃測定TaLac對ABTS［ε420=38 000 L/（mol·cm）］、SGZ［ε530=64 000 L/（mol·cm）］、guaiacol［ε470=26 600 L/（mol·cm）］和 DPA［ε300=2 835 L/（mol·cm）］的酶活力。

1.2.9 TaLac對MG的脫色 在20 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.0）、1 mmol/L CuSO4緩沖液中，加入0.8 mg/L TaLac和50 mg/L MG染料，分別在添加ABTS和不添加0.1 mmol/L ABTS的情況下，于60℃反應一定時間后，測定反應體系在617 nm處的吸收值。以未添加酶液的反應體系為對照，計算TaLac對MG的脫色率：脫色率（%）=（A0-A）/A0×100%，其中A0為未添加酶液反應體系的OD值，A為添加酶液反應體系的OD值。

1.2.10 MG的脫色產物的毒性評價 50 mg/L MG經TaLac于60℃處理3 h后，pH調整為7.0以減少對玉米萌發的影響。將玉米種子分別置于含有ddH2O（對照組）、未經TaLac處理的MG以及經TaLac處理后的MG脫色產物的保溫盒中，于25℃下避光培養5 d，記錄玉米種子發芽情況，測定胚芽和胚根的長度。

1.2.11 數據分析 文中相關實驗至少重復3次，相應數值使用平均值±標準偏差表示，使用Excel進行數據統計。

2 結果

2.1 TaLac的生物信息學分析

TaLac具有244個氨基酸殘基，理論分子質量為26.1 kD，理論等電點為7.1。序列比對結果（圖1-A）顯示，TaLac與已研究DUF152家族成員RL5、Tfu1114和LaclK的序列一致性分別為27.6%、36.5%和23.5%。TaLac具有DUF152家族保守的氨基酸殘基，如可能的銅原子結合位點H66、C100和H116（圖1-A）。TaLac的結構模型顯示，TaLac與結構已解析的DUF152家族成員GsYlmD具有相似的三級結構（圖1-B）。

2.2 TaLac的克隆、表達及純化

重組質粒pET28a-TaLac表達的TaLac蛋白C末端帶有6×His標簽，可利用Ni親和層析法進行純化（圖2）。TaLac在BL21（DE3）中呈可溶性表達形式。在SDS-PAGE顯示，純化后的TaLac蛋白處于25-30 kD之間（圖2-B）。TaLac經Ni親和層析法純化后純度可達到95%以上，滿足后續酶活性分析要求。

圖2 TaLac的克隆及純化Fig.2 Cloning and purification of TaLac

2.3 TaLac的酶學性質

2.3.1 溫度和pH對TaLac活力的影響 TaLac可氧化漆酶的經典底物DMP。以DMP為底物，測定TaLac催化的最適條件。結果（圖3-A、B）表明，TaLac的最適pH為5.0，最適溫度為60℃。TaLac在50℃和60℃分別處理4 h后，仍保留原始活力的80%和52%（圖3-C）。

圖3 pH和溫度對TaLac活力的影響Fig.3 Effects of pH and temperature on the activity of TaLac

2.3.2 TaLac的動力學和底物特異性分析 以DMP為底物，最適條件下測得TaLac的動力學參數Km為0.74 mmol/L，kcat為1.61/min（圖4-A）。除了可以氧化DMP外，TaLac還可以DPA和愈創木酚為底物；但TaLac不能催化以ABTS和SGZ為底物的氧化反應（圖4-B）。

圖4 TaLac的底物特異性（A）和對DMP的動力學參數（B）Fig.4 Substrate specificity of TaLac（A）and kinetic parameters against DMP（B）

2.3.3 金屬離子對TaLac活力的影響 在體系中沒有Cu2+時，TaLac完全失去催化活性；在1、2和5 mmol/L Cu2+條件下，TaLac能夠發揮最大酶活力；當Cu2+濃度升高至10 mmol/L時，TaLac部分活性被抑制（圖5）。當EDTA螯合去除溶液中Cu2+后，TaLac失去催化活力（圖6）。

圖5 TaLac活力對Cu2+的依賴Fig.5 Dependence of TaLac activity on Cu2+

如圖6所示，在10 mmol/L二價金屬離子Mg2+、Ca2+、Mn2+和Ba2+的作用下，TaLac的活力提高至原有活力的120%-135%，說明這些金屬離子可以提高TaLac的活力；而在10 mmol/L Zn2+的影響下，TaLac可發揮92%的酶活力。

圖6 金屬離子對TaLac活力的影響Fig.6 Effects of metal ions on the activity of TaLac

2.4 TaLac對MG的脫除

2.4.1 ABTS對TaLac脫除MG的影響 由圖7可知，在無介體輔助的情況下，TaLac在4 h對50 mg/L MG的脫色率可達67%。而在ABTS介體的作用下，TaLac在0.5 h時對MG的脫色率為58%，2 h時脫色率達到90%，在3 h即可對MG完全脫色。

圖7 TaLac催化MG的脫色Fig.7 Decolorization of MG catalyzed by TaLac

2.4.2 MG脫色產物的毒性評價 利用玉米萌發實驗評價TaLac脫除MG后產物的毒性。如表1所示，未經TaLac處理的50 mg/L MG組的玉米發芽率、胚芽長度和胚根長度顯著低于對照組。經TaLac處理的MG脫色產物組玉米的發育率為100%、胚芽長度為1.55 cm、根長為5.25 cm，與對照組相比無顯著差異（表1）。

表1 MG及其脫色產物的植物毒性實驗Table 1 Phytotoxicity test of MG and MG decolorized products

3 討論

印染行業是我國的傳統支柱產業，我國每年染料的生產量可達90余萬t［16］。由于染料利用效率低下，致使超過11%的染料被排入印染廢水中［17］。由于染料結構穩定、色度高、毒害作用大，導致印染廢水難以處理。印染廢水的肆意排放，會嚴重抑制水體生物的生長發育；并且，有毒有害染料在水產及農作物中的富集，嚴重威脅人體的健康［7，18-20］。漆酶可有效降解染料，降低其毒害作用，在印染廢水的綠色處理中具有巨大的應用潛力。因此，新型漆酶的挖掘及鑒定具有重要的理論意義和應用價值。

本研究在嗜熱菌水生棲熱菌中挖掘到DUF152家族成員TaLac，該蛋白分子量為26.1 kD，與已鑒定DUF152家族漆酶成員大小相當，均遠小于經典漆酶的分子量［11-13］。TaLac與已鑒定DUF152家族漆酶的同源性在23%-36%，具有家族內保守的銅原子結合位點和相似的高級結構，極有可能是具有催化活性的DUF152家族漆酶。

TaLac在大腸桿菌中過量表達，利用Ni離子親和層析1步純化即可得到高純度的TaLac蛋白。TaLac可氧化愈創木酚、DPA和DMP，驗證了生物信息學的分析結果；而同家族的LaclK只能夠氧化DPA和DMP，不能夠催化愈創木酚的氧化反應［13］。TaLac對DMP底物的動力學參數Km為0.74 mmol/L，與同家族的LalK（0.46 mmol/L）、Tfu1114（1 mmol/L）相當［12-13］。來源于嗜熱菌的TaLac具有較好的熱穩定性，在50℃孵育4 h后，活性保留80%；60℃孵育4 h后，活性保留52%。不同來源漆酶的熱穩定性差異較大。一色齒毛菌（Cerrena unicolor）漆酶LacT-1在50℃處理1 h后僅保留40%活性，60℃處理1 h后失去全部活性［21］。地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）ANSB821漆酶CotA分別在50和60℃熱處理2 h后，活力僅剩余40%和30%［22］。TaLac良好的熱穩定性與其水生棲熱菌的來源相關。水生棲熱菌來源的Taq DNA聚合酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶等均具有極高的耐熱性［23-24］。

10 mmol/L Zn2+僅使TaLac活力降低8%，而10 mmol/L Mg2+、Ca2+、Mn2+和Ba2+則不同程度地促進TaLac的活力，表明TaLac可耐受高濃度的二價金屬離子。Cu2+對于漆酶的催化反應是必需的。TaLac的活性嚴格依賴于Cu2+。在沒有Cu2+時，TaLac沒有漆酶活性；0-5 mmol/L Cu2+促進TaLac的活性；10 mmol/L Cu2+則抑制了TaLac的活性。該結果表明，Cu2+參與了TaLac對DMP的氧化反應，即TaLac與Cu2+具有相互作用。但TaLac與已鑒定DUF152家族中可能的Cu2+結合位點不同于經典漆酶［11-13］。電感耦合等離子體質譜實驗表明每個RL5分子可能結合4個銅原子，但Tfu1114與LaclK的研究表明每個漆酶分子結合1個銅原子［11-13］。Cu2+與DUF152家族漆酶的結合比例與相互作用方式仍不清晰，有待進一步研究。定點突變與等溫滴定量熱法的結合，可以確定TaLac與Cu2+的結合比例、結合位點等信息；TaLac與Cu2+高級結構的解析，能夠更進一步闡明Cu2+在DUF152家族漆酶催化反應中的作用，解釋該家族漆酶的催化機制是否與經典漆酶一致。

MG大量應用于印染等工業，其無序排放對自然環境、動植物乃至人類形成巨大的威脅。熱穩定性好、金屬耐受性高的TaLac在條件復雜的MG廢水中具有應用潛力。實驗表明，TaLac可高效脫除MG。TaLac于60℃在4 h內對MG的脫色效率達到67%。介體的加入，可提高漆酶對污染物的降解效率［2，25］。在ABTS的輔助下，TaLac可于3 h內完全脫除MG。同樣在ABTS的參與下，LaclK在1 h內對9 mg/L MG的脫色效率不足40%［13］；一色齒毛菌漆酶LacT-1在12 h內對MG的降解效率為95%［21］。同溫層芽孢桿菌BCMC2漆酶BaCotA對MG僅具有微弱的降解活性；而在ABTS存在時，BaCotA于3 h可降解82% MG［26］。值得注意的是，TaLac和LaclK均不能催化ABTS的氧化，但ABTS卻能加速TaLac和LaclK對MG的脫色反應［13］。該現象無法使用經典的漆酶介體系統機制進行解釋，可能與DUF152家族漆酶的催化機制相關，需要進一步的研究。MG經TaLac處理后顏色的高效脫除，表明MG的生色基團受到破壞。因此，TaLac可能與白腐真菌齒毛菌（Cerrena sp.）漆酶LacA、棘孢木霉（Trichoderma asperellum）漆酶等經典漆酶一致，通過氧化作用等降解MG，進而實現MG的脫色［10，27］。TaLac對MG的具體降解途徑仍待液相色譜質譜聯用等方法進一步的確定。

漆酶對MG的降解是否可以脫除MG的毒性，需要進一步的研究。本研究利用玉米萌發實驗評價MG脫色產物的毒性，該方法也被用于評價活性黑5染料的毒性［28］。MG組中玉米種子的發芽僅為33%，且發芽種子的胚芽及胚根長度顯著低于對照組，表明MG對玉米發芽及生長的嚴重抑制作用。經TaLac處理后的MG組中玉米的發芽及生長基本不受抑制，說明TaLac完全消除了MG對玉米的毒害作用。然而，MG經LacA漆酶處理后毒性雖然顯著降低，但仍對煙草、萵苣的生長有一定的抑制作用［27］。綜上，TaLac可對MG進行高效脫色及脫毒。

4 結論

在嗜熱菌水生棲熱菌篩選到具有漆酶活性的DUF152家族成員TaLac。TaLac具有DUF152家族保守的銅原子結合位點，有較好的溫度穩定性，且能夠耐受高濃度的 Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+和 Ba2+等金屬離子。在ABTS介體的輔助下，TaLac可在3 h完全脫除50 mg/L MG，并且TaLac的處理徹底消除了MG對玉米的毒害作用。因此，DUF152家族漆酶TaLac在MG污染水體的修復中具有應用潛力。