TRV介導的小報春基因沉默技術體系的建立

付偲僮 司未佳 劉穎 程堂仁 王佳 張啟翔 潘會堂

（北京林業大學園林學院 國家花卉工程技術研究中心 花卉種質資源創新與分子育種北京市重點實驗室 城鄉生態環境北京實驗室，北京 100083）

基因功能驗證常用的方法有轉基因、RNA干擾、基因敲除和酵母雜交等，但大部分基因驗證方法都依賴于穩定的遺傳轉化體系。穩定遺傳轉化體系的構建步驟繁瑣、耗時，且依賴傳統遺傳轉化體系的基因功能驗證不適用于無穩定遺傳轉化體系的物種。因此在無遺傳轉化體系的物種中，基因沉默（gene silencing）驗證則需要另辟蹊徑。

基因沉默是真核生物細胞基因表達調控的一種重要手段，是植物自身防御病毒入侵的一種自然機制。病毒誘導的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是利用病毒載體攜帶植物目的基因片段，通過各種方式侵染植物，重組病毒在植物中復制產生雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA），在植物自身防衛反應轉錄后基因沉默（post transcriptional gene silencing，PTGS）的機制作用下，dsRNA進一步產生siRNA（small interference RNA，siRNA），該產物能夠誘導與其具有同源性的植物內源目的基因mRNA的降解，根據表型變異來進行基因功能分析，實現植物基因功能的快速鑒定［1］。相比于傳統的轉基因技術，VIGS技術具有沉默效率高、周期短、操作簡單、經濟實惠等優點，并且不需要事先知道并克隆基因全長，也無需建立遺傳轉化體系，只需要一段300-500 bp的基因片段就能快速獲得表型，進行基因功能的驗證［2］。目前，已經成為植物基因功能研究領域最具有吸引力的技術之一。煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）具有基因組較小，可以侵染植物生長點，不產生典型病毒性狀，便于改造等優點，是目前在植物中應用最廣泛、效果最好的 VIGS 病毒載體［3］，對包括番茄［4］、煙草［5］、辣椒［6］等在內的植物有良好的侵染效果。

花柱異型現象能夠促進異花授粉，是植物界經典的適應性范例，是被子植物多樣性形成的核心因素之一［7］。小報春作為典型的花柱二型植物，是研究花柱二型形成機制的理想材料。但是報春花屬植物的體外再生非常困難，關于報春花屬植物的再生體系和遺傳轉化體系的研究較少。前人以歐報春葉片為外植體得到了愈傷組織［8］，Hayta等［9］報道了兩種農桿菌介導的歐報春遺傳轉化系統，一種是農桿菌介導的真空滲透幼苗，能夠實現在歐報春中的瞬時轉化；一種是根癌農桿菌感染的花梗外植體，平均轉化率為4.6%，具有穩定的轉基因整合和轉化到下一代的能力，但這一方法轉化效率低，難以實現大規模的基因功能分析。因此，建立小報春VIGS基因沉默體系成為基因功能驗證亟待解決的關鍵問題。

PDS是類胡蘿卜素合成途徑中的限制酶，參與植物類胡蘿卜素的合成累積。PDS基因沉默會影響植物番茄紅色的積累，番茄植株的綠色部分（葉子和綠色果實）因為缺乏該酶而導致葉綠體對光極度敏感，出現典型光漂白表型，因此變成白色［3］。由于植物不同部位均出現容易觀察的沉默表型，PDS在VIGS體系建立過程中得到廣泛應用。

近年來，VIGS技術已經被廣泛應用于番茄［4］、蘋果［10］、玉米［11］、棉花［12］、葡萄［13］等作物中，但尚沒有在小報春中建立VIGS體系的報道。

本研究以實驗室培育的小報春新品種‘紅星’為試驗材料，利用小報春的PDS（八氫番茄紅素脫氫酶）基因作為標記基因，構建TRV2-PfPDS重組載體，以期構建小報春VIGS體系，為小報春的基因功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 將小報春種子播種在穴盤中，置于北京林大林業科技有限公司的人工氣候室中，培養條件為光照時間16 h，溫度22℃，黑暗時間8 h，溫度18℃，相對濕度60%。約2個月后將小報春的種苗移植到直徑10 cm的花盆里，一周后有新葉長出時用于侵染。另外，在濕潤的濾紙上播種小報春種子，分別培養至白色胚軸剛剛伸出和長出子葉2種發育階段，用于真空侵染。

1.1.2 病毒載體和菌株 TRV病毒載體pTRV1和pTRV2由中國農業大學傅達奇教授惠贈，載體圖譜如圖1所示，所選用大腸桿菌（Escherichia coli）感受態為DH5α（CD201-02，全式金，北京），農桿菌感受態為GV3101（BC304-01，博邁德，北京）。

圖1 TRV1和TRV2載體圖譜Fig.1 Vector map of TRV1 and TRV2

1.2 方法

1.2.1 報告基因擴增 從小報春轉錄組中篩選出小報春PDS基因（PfPDS）序列，在其ORF框內選取302 bp長度的片段。參考In-fusion引物設計原則設計引物（上游引物為5′-TTAAGGTTACCGAATTCAT ACCGGCTTGTGAC-3′，下游引物為 5′-GCTCGGTACC GGATCCGCAAATCGATGCACT-3′），由上海生工生物有限公司合成。反應體系為cDNA 2 μL（80 ng/μL）、上游引物 2 μL（100 μmol/L）、下游引物 2 μL（100 μmol/L）、2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL 和 ddH2O 19 μL。離心混勻后按以下反應體系進行擴增，反應程序為 94℃ 5 min ；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環；72℃ 10 min。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，將正確的條帶切下后進行回收。

1.2.2 重組載體構建 用限制性內切酶BamH I和EcoR I對TRV2質粒進行雙酶切。反應體系為TRV2 質 粒 1μg、BamH I 0.7 μL（10 U）、EcoR I 0.7 μL（10 U）、10×K Buffer 5 μL，ddH2O 補 至 50 μL。37℃酶切3-4 h后膠回收。將1.2.1得到的基因片段與線性TRV2載體通過In-fusion連接法，50℃15 min，轉化大腸桿菌，篩選陽性克隆進行菌液PCR鑒定陽性重組子。經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將含有目的條帶的菌液送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。

1.2.3 菌液制備及侵染 取5 μL測序正確的重組質粒TRV2-PfPDS轉化農桿菌感受態GV3101，28℃培養2 d，挑取外形圓潤的單個菌斑于1 mL含有50 μg/mL卡那霉素、50 μg/mL慶大霉素、25 μg/mL利福平的液體LB培養基中28℃搖菌（150 r/min）培養。

以菌液∶誘導LB=1∶20的比例，將搖好的菌液轉入誘導LB中（其中卡那霉素工作濃度為50 μg/mL，慶大霉素工作濃度為50 μg/mL，利福平工作濃度為25 μg/mL，MES工作濃度為10 mmol/L，AS工作濃度為20 μmol/L），在28℃下震蕩培養12-16 h（150 r/min）。

將培養好的誘導LB菌液以5 000 r/min離心5 min后，棄上清，用侵染液重懸菌體。將菌液調至所需濃度（OD600）后室溫下靜置3-4 h。最后將含有TRV1的菌液與含有TRV2-PfPDS的菌液按體積比1∶1混合，待用。

1.2.4 沉默體系的構建 侵染方式：在同樣的OD600和侵染液配方的條件下，研究葉背注射、葉柄注射、真空滲透侵染剛露白種子或長出子葉的種苗4種方式的侵染效率。具體方法如下：將OD600調至1.0，侵染液為無菌水中含有10 mmol/L MES、10 mmol/L MgCl2和 200 μmol/L AS。（1）葉背注射法 ：用 5 mL一次性注射器吸取侵染液并拔掉針頭，將注射器對準葉片的背面，避開葉脈，用食指隔著葉片抵住注射口，將侵染液注入葉片中，以觀察到葉片呈現浸漬狀為宜。對每片葉進行注射，確保侵染液進入植株內部。（2）葉柄注射法：用5 mL一次性注射器吸取侵染液后，用針頭輕輕劃傷葉柄（不能將葉柄折斷），在傷口處注射少量侵染液。為保證侵染液進入植株內部，對每個葉柄進行注射。2種侵染方式各處理10株小報春。（3）真空滲透侵染剛露白種子或長出子葉的種苗：將分別培養至種子剛露白和長出子葉的小報春用于真空滲透侵染，設置3種壓強（-25、-50和-75 kpa）及3種侵染時間（30 s、2 min和5 min），每組處理20粒種子。葉背注射、葉柄注射、真空滲透4種侵染方式均設置相應的空載組和對照組。所有植株在侵染后遮光處理24 h，之后在人工氣候室（光照時間16 h，溫度22℃，黑暗時間8 h，溫度18℃，濕度60%）中培養。

菌液濃度與侵染液配方：設置4種侵染液配方及菌液OD600（表1），合計16組處理，每組處理設置對應的空載組和對照組，采用葉背注射法侵染5株小報春，所得數據使用SPSS和Excel軟件進行分析。

表1 侵染液菌液濃度及配方Table 1 OD600 value and combinations of infiltration liquid

提取出現白化表型植株不同部位的RNA，同時提取空載組和對照組的RNA，分別反轉為用于載體檢測和表達量檢測的2種cDNA，用于載體檢測的cDNA使用TIANScript RT Kit（KR104，天根，北京）反轉錄試劑盒，用于表達量檢測的cDNA使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with Gdna Eraser（RR-047A，TaKaRa，日本）反轉錄試劑盒，具體操作見試劑盒說明書，引物詳細信息見表2。

表2 病毒載體檢測及表達量檢測引物Table 2 Primers for viral vector detection and gene expression level detection

2 結果

2.1 小報春VIGS體系的最佳侵染方式

比較葉背注射、葉柄注射、真空滲透種子和真空滲透具有兩片子葉的幼苗4種侵染方式的侵染效率，OD600均為1.0，侵染液均為無菌水中加入200 μmol/L AS+10 mmol/L MgCl2+10 mmol/L MES。侵染后第16天首次觀察到白化現象，白化現象均出現在新生的葉片上，侵染40 d后不再有新的植株出現白化現象（圖2），白化植株表型持續變化，一直到開花，白化現象在葉片、花葶、花梗、花萼等部位均能出現（圖3）。通過葉背注射法侵染小報春的效率達60%，而葉柄注射法的侵染效率為30%。真空滲透侵染法無論是侵染剛露白的種子還是帶兩片子葉的幼苗，白化現象均不如注射法侵染的植株表現明顯，僅在葉脈處出現白化現象（圖4），利用這兩種方法首次觀察到白化現象是在侵染37 d后。兩種方法中，帶兩片子葉的幼苗要比剛伸出胚軸的種子侵染效率高。對于剛剛伸出胚軸的種子，壓強為-25 kpa時侵染效率最高，且侵染時間越長效率越高，而對于兩片子葉的幼苗，壓強為-75 kpa時侵染效率最高，侵染效率與侵染時間長短無關（表3）。綜上所述，小報春最佳的侵染方式為葉背注射法。

表3 真空滲透法侵染小報春萌發種子和帶子葉幼苗的效果Table 3 Infection efficiency on P.forbesii when seeds with hypocotyl and cotyledons infected by vacuum infiltration

圖3 PfPDS沉默后小報春的白化現象Fig.3 Whole plant albino after PfPDS gene silenced in P.forbessii

圖4 真空滲透法侵染小報春后PDS基因的沉默效果Fig.4 Silencing effect of PDS gene in P.forbesii infected by vacuum infiltration method

2.2 小報春VIGS體系的最佳菌液濃度與侵染液配方

以葉背注射法侵染葉片，在侵染16 d后開始出現白化現象，在侵染20 d后不再出現新的白化植株，最高侵染效率為40%，空載組和對照組無明顯變化（圖2）。從16組處理結果來看（表4），侵染效率沒有表現出與OD600或侵染液配方具有明顯的相關性。結合2.1的結果，綜合考慮節約藥品與操作的方便性，選擇OD600為1.0，侵染液配方為無菌水中加入200 μmol/L AS+10 mmol/L MgCl2+10 mmol/L MES 作為最佳的菌液濃度和侵染液配方。

表4 不同OD600與侵染液配方侵染小報春的效率Table 4 Infection efficiency of different OD600 values and different formula of infiltration liquid on P.forbesii

圖2 注射法侵染小報春后PDS基因沉默效果Fig.2 Silencing effect of PDS gene infection in P.forbesii

2.3 病毒載體檢測與表達量檢測

利用TRV病毒載體上的引物（表2）進行PCR，在出現白化現象的植株和空載組中均檢測到了TRV1和TRV2病毒載體，對照組中沒有檢測到2種病毒載體（圖5），說明不同的侵染方式都能使攜帶有病毒載體的菌液進入植株內部，并且病毒載體能夠轉移到新生器官中，出現白化現象的植株PfPDS表達量顯著低于空載組和對照組。而真空滲透法侵染的植株PfPDS下調不明顯，沉默效率低，表型變化小（圖6）。比較基因沉默后小報春不同部位PDS基因表達量，發現葉片、花梗、萼片中PfPDS TRV2植株PDS基因表達量均顯著低于空載組和對照組（圖7）。

圖5 基因沉默后小報春植株病毒載體檢測結果Fig.5 Detection results of virus vector in P.forbessii after gene silencing

圖6 使用不同方法基因沉默后小報春PDS基因的表達量檢測Fig.6 Detection results of PDS gene expression after gene silencing by different methods

圖7 基因沉默后小報春植株不同部位PDS基因的表達量檢測Fig.7 Detection of PDS gene expression in different parts of P.forbessii after gene silencing

3 討論

小報春是報春花科報春花屬的典型花柱異型植物，本研究構建的小報春VIGS體系能夠使白化植株表型持續變化，一直到開花，白化現象在葉片、花葶、花梗、花萼等部位均能出現。說明病毒載體能夠在植株內部轉移并且在花部器官能夠表達，該體系能夠用于研究花柱異型以及其它性狀如花香、耐熱等科學問題。

確保帶有重組載體的菌液進入植株體內，是VIGS技術成功與否的決定性因素。不同植物有各自最適的侵染方式，本研究所用的注射侵染法適用于肉質、柔軟的葉片，如番茄的子葉、煙草的幼嫩真葉，該類葉片組織結構松軟，注射器造成較小的傷口后即可利用壓力將侵染液快速的浸潤到整個葉片從而完成侵染；該方法不適合葉片比較薄而脆、葉脈較多的植物，如大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）和小麥（Triticum aestivum）等。這類植物葉片較窄、偏紙質，用真空滲透侵染法侵染種子具有較好效果。Zhang等［14］利用抽真空方式使帶有PDS基因的病毒載體進入發芽的小麥和劃傷的玉米種子中，最終獲得全株白化的苗子。許多木本植物葉片與草本植物相比偏革質或蠟質，較難侵染。利用幼嫩的扦插苗或組培苗則會更容易侵染，在月季（Rosa chinensis）和觀賞海棠（Malus spectabilis）的研究中有采用真空滲透侵染法侵染組培苗的報道［15-16］。針對具體物種構建最適的體系是十分必要的。

八氫番茄紅素去飽和酶（phytoene desaturase，PDS）是類胡蘿卜素合成途徑中的限制酶，參與植物類胡蘿卜素的合成累積。PDS基因沉默會影響植物番茄紅色的積累，番茄植株的綠色部分（葉子和綠色果實）因為缺乏該酶而導致葉綠體對光極度敏感，出現典型光漂白表型，綠色的植物葉片因此變成白色［8］。由于植物不同部位均出現容易觀察的沉默表型，PDS在VIGS體系建立過程中得到廣泛應用，但其最大缺點是破壞了葉綠體而影響植物的正常生長發育。通常研究植物的葉片表型時建議使用PDS基因，如要研究果實表型，則以番茄紅素合成酶基因PSY1為佳，因為該基因沉默后只會導致紅色的果實變成黃色，不會導致植物綠色部分發生顏色變化［17］。

Fu等［18］利用多種侵染方式對番茄果實中控制果實成熟相關的基因進行沉默后，發現同一個果實上會同時出現綠色未成熟和紅色成熟的兩種狀態，但出現表型的部位僅在侵染的部位，不會出現在未侵染的部位。本研究中，幼苗期侵染葉片后，在整個植株的各個部位均有白化現象出現，說明病毒會在植株內轉移，這種轉移的能力可能與侵染的部位和時期有關，病毒更傾向于向新生部位轉移。王旭等［19］將含有pTRV2-PDS菌液注射到刺萼龍葵葉背和幼根處，光漂白現象不僅在葉片上出現，在部分花瓣上也出現了白化現象。

VIGS是一種瞬時轉化技術，由于瞬時轉化基因沒有結合到染色體上，所以VIGS基因沉默是不穩定的，侵染一段時間后沉默效果會有所衰減，表型也會恢復［20］。大部分研究所報道的VIGS表型持續時間較短，從3周到3個月不等［21-23］。小報春作為一種二年生植物，開花結實后會自然死亡。但在長日照條件下，延長小報春營養生長時間便可延長其整個生命周期。一些植株從幼苗期侵染至結實后衰老死亡整個過程中都持續表現白化現象，說明病毒載體能在小報春體內存活較長的時間，可達12個月左右。由于沉默效果持續較長，大大提高了VIGS技術在小報春相關研究中的實用性，有望在小報春基因功能研究中發揮積極作用。

4 結論

構建了PfPDS-TRV2載體，探索了最佳侵染部位、侵染液配方、菌液濃度和侵染方式，用含有200 μmol/L乙酰丁香酮（AS）、10 mmol/L MgCl2和10 mmol/L乙磺酸緩沖液（MES）的侵染液，將菌液OD600分別調至1.0，混合后通過葉背注射方式侵染小報春能夠有效地沉默基因，侵染效率達60%，沉默表型可持續12個月，并能在小報春植株的各部位（從葉片到萼片）均起到沉默作用。