黑色素瘤相關抗原A基因在乳腺癌中的表達及其臨床意義

范曉杰，李清靖，谷麗娜，桑梅香，單保恩，*

（1．河北醫科大學第四醫院病理科，河北石家莊 050011；2．河北醫科大學第四醫院檢驗科，河北 石家莊 050011；3．河北醫科大學第四醫院科研中心，河北 石家莊 050011)

乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤，根據全球癌癥(GLOBOCAN 2020)估計，2020 年，全球約有230 萬新發乳腺癌病例和65.5 萬例乳腺癌死亡病例，發病率和死亡率處于較高水平[1]。而在我國，女性乳腺癌的發病率和死亡率同樣處于高水平，分別占全球發病病例和死亡病例的18.4%和17.1%，嚴重危害著我國女性的生命健康[2]。黑素瘤相關抗原(melanomaassociated antigens， MAGE) 家 族 是 癌/睪 丸 抗 原(cancer testis antigen，CTA)家族的一員[3]。根據基因結構和組織特異性，MAGE 家族又分為MAGE-I 和MAGE-II 兩類，MAGE-I 類包括MAGE-A、B 和C 亞族，MAGE-As是I類抗原中研究較為廣泛的家族，位于X染色體q28區，包括12個家族成員，分別命名為MAGE-A1~A12，除睪丸、胎盤組織外，在人體其他正常組織中均不表達，但在多種人類惡性腫瘤組織內呈高表達狀態，提示MAGE-As 有可能作為特異性腫瘤標記物[4]。本研究采用多重巢式PCR(multiplex seminested PCR)和酶切方法檢測106例乳腺癌患者和30例健康人外周血中MAGE-As(MAGE-A1、A2、A3、A4和A6)mRNA 以及單個基因亞型的表達情況，同時檢測了對應的106例乳腺癌組織中MAGE-As蛋白的表達情況，分析MAGE-As基因表達與患者臨床病理指標及預后的關系，旨在探討外周血中MAGE-As基因的mRNA 是否可能作為特異性腫瘤標記物，用于判斷乳腺癌患者的預后。

1 材料與方法

1.1 研究對象

標本取自河北醫科大學第四醫院2012 年7 月—2013 年5 月期間的乳腺癌手術患者106 例，全部患者均為首次發病，術前均未接受任何放、化療和內分泌治療。術前收集患者外周血5 mL，每例患者均取乳腺癌原發灶組織，常規石蠟包埋，制成厚4 μm 的病理切片，經HE 染色，并由兩位病理醫師共同確定為乳腺癌組織，用于后續免疫組織化學檢測。另選取河北醫科大學第四醫院檢驗科30 例健康志愿者外周血5 mL作為陰性對照；正常睪丸組織作為陽性對照，其標本取自前列腺癌去勢治療中收集的正常睪丸組織。平均年齡(48.9±11.8)歲，進行免疫組織化學檢測的標本經4%多聚甲醛固定，所有臨床病理指標包括病理學類型、組織學分級、臨床分期、腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移、雌激素受體(ER)表達、孕激素受體(PR)表達和表皮生長因子受體(HER2)表達情況。上述樣本的獲取均取得受試者或其家屬的知情同意并簽署知情同意書，研究方案已獲得醫院倫理委員會審查批準(倫理審查編號2020KY004)。

1.2 主要試劑

血液總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；反轉錄試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；Go Taq Green Master Mix 購自美國Thermo 公司；瓊脂糖購自英國OXOID公司；PCR引物購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；QIA quick PCR 產物純化試劑盒購自QIAGEN 公司；BclⅠ、EcoRⅠ、SPhⅠ購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司；Eco47Ⅲ購自Thermo 公司，AflⅢ購自New England Biolabs公司；鼠抗人MAGE-A(6C1)單克隆抗體購自美國Santa公司。

1.3 引物設計

引物選自前期課題組的研究[4]。第一輪PCR 引物，MAGE-1，上 游5′-ACTGGCCCTGGCTGCAAC-3′，下游5′-GCCCTGACCAGAGTCATCAT-3′(目的片段長度993 bp)；MAGE-1-1，上游5′-ACTGGCCTTG GCTGCAAC-3′，下 游5′-CCCTGACGAGAGTCATCA TG-3′(目的片段長度965 bp)。第二輪PCR 引物，MAGE-2，上游5′-ACTGGCCCTGGCTGCAAC-3′，下游5′-AGGCCCTGGGCCTGGTG-3′(目的片段長度914 bp)；MAGE-2-2，上游5′-ACTGGCCTTGGCTGCAAC-3′，下游5′-AGGCCCTGGGCTTGGTG-3′(目的片段長度893 bp)。GAPDH 引物，上游5′-ACCTGACCTGCC GTCTAGAA-3′，下游5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。引物由上海生工公司合成與純化。

1.4 RNA完整性鑒定

將提取的總RNA 于1.5%瓊脂糖凝膠中，恒壓80 V(電泳緩沖液1×TBE)電泳30 min 后，將凝膠移至紫外投射儀下進行觀察結果。

1.5 多重巢式PCR檢測乳腺癌患者外周血中MAGEAs mRNA的表達水平

用血液總RNA提取試劑盒分別從乳腺癌患者和健康人血漿中提取總RNA，用反轉錄試劑盒進行反轉錄。第一輪PCR 反應體系為模板cDNA 5 μL，10 μmol/L 的MAGE-1F 和MAGE-1R 各1 μL，10 μmol/L的MAGE-1-1F 和MAGE-1-1R 各0.2 μL，2×Taq Master Mix(含染料)25 μL，去離子水加至總體積為50 μL。第二輪PCR 反應體系為首輪PCR 產物5 μL，10 μmol/L 的MAGE-2F 和MAGE-2R 各2 μL，10 μmol/L 的MAGE-1-2F 和MAGE-1-2R 各0.4 μL，2×Taq Master Mix(含染料)50 μL，去離子水加至總體積為100 μL。兩輪反應條件均為：95 ℃、5 min，95 ℃、45 s，65 ℃、45 s，72 ℃、90 s，31 個循環，72 ℃、6 min。取PCR 產物6 μL，用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠成像系統中觀察擴增結果。

1.6 限制性內切酶處理獲取MAGE-As基因片段

使用QIA quick PCR 產物純化試劑盒，按照說明書將以上獲得的PCR產物進行純化。將純化后PCR產物分組，分別用限制性內切酶BclⅠ、SPhⅠ、EcoR Ⅰ、Eco47 Ⅲ和AflⅢ進行單酶切，得到MAGE-A1、A2、A3、A4和A6的不同基因片段(表1)。酶切產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠成像系統中觀察結果。

表1 限制性內切酶處理MAGE-As多重巢式PCR產物后的酶切片段

1.7 免疫組織化學染色

免疫組化選用Roche Benchmark XT 全自動免疫組化儀染色。一抗MAGE-A(克隆號6C1，1∶200)，以PBS 代替一抗作為陰性對照，用正常睪丸組織切片作為陽性對照。

1.8 免疫組織化學結果判定

免疫組化切片均由2 名資深病理科醫師雙盲獨立觀察評估。由于MAGE-As 在乳腺癌中的陽性閾值尚未明確，本實驗MAGE-As 以細胞質或細胞核出現黃色至棕褐色顆粒為陽性顯色。MAGE-As 表達采用半定量積分法，結合染色強度和陽性細胞百分比來評定陽性表達病例。先在低倍鏡下觀察切片整個視野，分別在腫瘤細胞及腫瘤間質隨機選擇5 個高倍視野(×400)。染色強度分級如下：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞密度分級為：陽性細胞數≤10%為1 分，10%~50%(含)為2分，＞50%為3 分。兩項得分相乘結果≥3 分為強陽性表達，＜1分為陰性表達。

1.9 統計學處理

用SPSS 17.0 統計學軟件對所有數據進行統計學處理，MAGE-As基因及單個MAGE-A基因表達與臨床病理學指標的關系采用卡方檢驗或Fisher 檢驗，應用Kaplan-Meier方法對乳腺癌患者是否陽性表達MAGEAs mRNA進行生存分析，應用Cox回歸模型針對陽性表達MAGE-As 及相關的臨床病理資料進行多因素分析。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 RNA完整性測定結果

完整的RNA 瓊脂糖凝膠電泳可明顯地觀察到28S和18S兩條帶，且28S的亮度和寬度是18S的兩倍。本研究通過凝膠成像儀觀察顯示(圖1)，可明顯地觀察到28S的亮度和寬度是18S的兩倍，提示睪丸組織、乳腺癌外周血及健康對照外周血所提取的總RNA具有良好的完整性。

圖1 瓊脂糖電泳檢測睪丸組織、乳腺癌及健康人外周血總RNA 的完整性

2.2 MAGE-As 基因(包括MAGE-A1、A2、A3、A4和A6)在乳腺癌外周血中的表達

多重巢式PCR檢測MAGE-As基因在睪丸正常組織(陽性對照)、乳腺癌患者外周血標本和正常健康人外周血(陰性對照)中的表達情況見圖2A，結果顯示，MAGE-As mRNA 在睪丸組織和乳腺癌患者外周血中表達，在健康人外周血中未見表達。MAGE-As mRNA在乳腺癌外周血中的部分表達情況見圖2B，結果顯示，MAGE-As mRNA 在乳腺癌患者外周血中表達率為40%(43/106)，健康人外周血中無表達(0/30)。統計學分析結果顯示(表2)，在乳腺癌患者外周血中，MAGE-A1、A2、A3、A4 和A6 表達率分別為10.3%(11/106)、19.8%(21/106)、15.1%(16/106)、13.2%(14/106)和5.7%(6/106)；MAGE-As基因表達率的順序為A2＞A3＞A4＞A1＞A6。

圖2 乳腺癌患者外周血中MAGE-As的表達

表2 106名乳腺癌患者外周血中MAGE-As基因的表達率

以乳腺癌患者Q 為例，其外周血MAGE-As mRNA表達的檢測見圖3A，MAGE-A2和A6的片段未被檢測到，依據所用內切酶SPhI，判定片段542 和375 bp 是MAGE-A4。MAGE-A1 和A3 片段大小略有不同，應用BclI 和Eco47 III 兩種內切酶，可以分別進行鑒定?；颊逨的外周血檢測結果見圖3B，MAGEA1、A3 和A4 片段未被檢測到，根據所用內切酶的不同，判定282 和438 bp 片段為MAGE-A6，151 和720 bp 片段為MAGE-A2?；颊逩 同時表達MAGE-A1、A2、A3、A4 和A6 共5 種基因(圖3C)，結果與BclI、SPhI、EcoR I、Eco47 III、和AflIII限制性內切酶切的片段一致。

圖3 部分乳腺癌患者外周血中MAGE-As經5種限制性內切酶處理后其家族成員的表達

2.3 MAGE-As mRNA 表達與乳腺癌患者臨床病理指標之間的關系

MAGE-As mRNA 表達水平與乳腺癌臨床病理指標之間的統計學分析見表3。結果顯示，MAGE-As在外周血的表達與病理學類型(χ2=2.818，P=0.244)、臨床分期(χ2=4.101，P=0.129)、腫瘤大小(χ2=0.482，P=0.786)、ER(χ2=0.133，P=0.715)、HER2(χ2=0.357，P=0.550)、PR(χ2=0.439，P=0.507)均無明顯相關性，但與年 齡(χ2=26.102，P=0.000)、組 織 學 分 級(χ2=60.115，P=0.000)、淋巴結轉移(χ2=9.929，P=0.002)和遠處轉移(χ2=15.402，P=0.000)相關。MAGE-A1 在外周血的表達僅與遠處轉移(χ2=12.981，P=0.000)相關；MAGEA2在外周血的表達臨床分期(χ2=12.218，P=0.001)和腫瘤大小(χ2=11.753，P=0.003)相關；MAGE-A4 僅與年齡(χ2=6.456，P=0.04)相關。

表3 乳腺癌患者外周血MAGE-As基因表達與臨床病理指標的相關性[百分率/%(例數)]

2.4 MAGE-As在乳腺癌患者外周血與組織中表達的相關性

免疫組織化學結果(圖4A和B)顯示，MAGE-As在人正常睪丸組織(陽性對照)細胞質和胞核內均有表達。MAGE-A1、A2、A3、A4 和A6 在外周血呈陽性表達對應的部分乳腺癌組織中的MAGE-As 蛋白陽性表達情況見圖4C~F。106 例乳腺癌組織中MAGE-As蛋白陽性表達率為45.3%(48/106)，統計學結果顯示，MAGE-As 蛋白表達與mRNA 表達具有較高的一致性，呈正相關(r=0.368，P＜0.01)。

圖4 免疫組化法檢測MAGE-A4在正常睪丸組織和乳腺組織中的表達

2.5 MAGE-As表達與生存的關系

對MAGE-As 和單個基因亞型MAGE-A1~A4 和A6 mRNA 表達陽性及陰性的患者生存曲線分別進行Log-Rank 檢驗，結果顯示，MAGE-As mRNA 陽性表達患者的5 年生存率顯著低于陰性表達的患者(P＜0.01)，見圖5A；單個基因亞型mRNA表達陽性患者的生存期顯著低于陰性的患者(P＜0.01)，見圖5B~E。采用Cox回歸模型進行多因素分析，結果顯示，MAGEAs mRNA 表達(HR=3.425，P=0.005)與淋巴結轉移(HR=2.487，P=0.036)情況是影響乳腺癌患者預后的獨立因素，見表4。

表4 乳腺癌患者總體生存預后的Cox回歸分析

圖5 K-M曲線分析乳腺癌患者5年總體生存率與MAGE-As基因表達的關系

3 討 論

循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)是從原發性腫瘤或轉移性病灶脫落到血液中的癌細胞，盡管某些原發性腫瘤中每天有數百萬癌細胞脫落，但只有一小部分CTC可能具有形成遠處轉移的能力[5-6]。研究發現，CTC 的數量和特征可以提供有關腫瘤進展和治療的關鍵信息[7-8]。在腫瘤發生的早期，CTC可以反映腫瘤的特征，判斷是否為惡性腫瘤，預測腫瘤轉移的風險；在腫瘤的晚期，CTC 可以幫助建立疾病的治療方法及評估預后。

對乳腺癌患者CTC的研究具有重要意義[9-10]。CTC已成為乳腺癌研究的熱點。目前，在乳腺癌中分離CTC 的計數平臺[11]是基于上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)標記蛋白的表達來富集CTC。研究表明，在乳腺癌中最具侵襲性的腫瘤細胞是那些經歷了上皮-間質轉化的細胞，該過程與EpCAM 以及其他黏附分子的表達下調有關[12-13]。因此，只關注表達EpCAM 的細胞可能會給研究帶來嚴重的限制，導致CTC未被檢測到，研究者們目前尚未找到一個非?？煽康娜橄侔┠[瘤特異性標志物。

多項研究發現[14-16]，MAGE-As基因在乳腺癌中是一種腫瘤特異性基因。故而提示MAGE-As基因的mRNA 有可能作為特異性腫瘤標記物，用于檢測乳腺癌外周血中的CTCs，從而預測乳腺癌的預后。由于MAGE-As基因的高度同源性，很難設計針對單個MAGE-As基因序列的引物。因此本研究利用多重巢式PCR 和酶切的方法檢測了106例乳腺癌患者和30例健康人外周血中MAGE-As mRNA 及單個基因亞型(MAGE-A1、A2、A3、A4和A6)的表達情況，并分析其表達與臨床病理指標及預后的關系。同時采用免疫組化的方法進一步檢測外周血對應的乳腺癌組織中MAGE-As 蛋白的表達的情況，分析外周血中MAGEAs mRNA表達與其相應腫瘤組織中表達的相關性。盡管研究MAGE-As基因在乳腺癌中的作用已有較多報道，但目前尚無相關研究表明MAGE-As基因可作為檢測乳腺癌外周血CTC的標志物。

在本研究中，MAGE-As基因在106 例乳腺癌患者外周血中有43 例(40%)表達，30 例健康對照者外周血中未見MAGE-As 表達。采用限制性內切酶處理檢測MAGE-As 各成員的表達情況，結果MAGE-A1、A2、A3、A4 及A6 mRNA 陽性表達率分別是10%(11/106)、21% (22/106)、 15% (16/106)、 13% (14/106) 和6% (6/106)。28 例乳腺癌患者外周血只表達一種MAGE-As基因，10 例乳腺癌患者外周血表達兩種MAGE-As基因，2 例乳腺癌患者外周血表達3 種MAGE-As基因，其中3 例乳腺癌患者外周血中同時表達5 種MAGE-As基因，以上結果提示檢測多個MAGE-As 家族成員可以克服單個MAGE-As基因亞型的異質性和低表達水平，與普通的單標志物檢測比較，多種標志物聯合應用更易于檢測出外周血中隱匿性腫瘤細胞。

本研究采用免疫組化的方法進一步檢測了相應的乳腺癌組織中MAGE-As 蛋白的表達的情況，統計學結果顯示，MAGE-As(包括MAGE-A1、A2、A3、A4和A6)蛋白在外周血對應的106例乳腺癌組織中的陽性表達率為45.3%，MAGE-As mRNA表達與蛋白表達具有較高的一致性，呈正相關(r=0.368，P=0.001)，進一步提示，MAGE-As 可以作為檢測乳腺癌患者CTC 的特異性生物標志物。

統計分析結果顯示，隨著年齡的增長，MAGE-As基因的表達率也增加，這可能與基因甲基化有關，增加了機體的遺傳不穩定性，基因甲基化誘導沉默基因表達[17]。隨著組織學分級的增加，MAGE-As基因的表達率也增加。MAGE-A2基因表達率隨著腫瘤大小的增加而增加，這與Otte等[18]的結果一致。Hamza等[19]的研究證明，腫瘤大小對于準確的分期至關重要。腫瘤大小決定乳房腫瘤切除術術式和是否需要新輔助治療[20]。因此，推測MAGE-A2有可能是促進腫瘤生長的基因。遠端轉移乳腺癌患者MAGE-As基因表達率顯著高于無遠端轉移乳腺癌患者。腫瘤的組織學分級、淋巴結轉移和遠處轉移均與較差預后有明顯的相關性。因此，MAGE-As基因的表達可能是檢測乳腺癌預后的重要指標之一。隨后本研究對MAGE-As基因和其家族各成員(MAGE-A1、A2、A3、A4 和A6)的表達與乳腺癌患者預后的關系進行了分析，結果顯示與MAGEAs 表達陰性的患者相比，MAGE-As mRNA 表達陽性乳腺癌患者的5年生存率較低。將MAGE-As及單基因型表達相關因素納入Cox 回歸模型，分析結果提示MAGE-As基因表達和淋巴結轉移可作為乳腺癌患者5年生存率的獨立危險因素。

綜上所述，外周血中MAGE-As基因的表達有可能提示循環血中存在腫瘤細胞，可能與乳腺癌的不良預后相關，可作為監測乳腺癌轉移和預后判斷的一個重要標記。以上研究只是一個初步的探索性研究，下一步我們將進一步增加樣本量進行更深入研究。