CuInS2/ZnS量子點對人卵顆粒細胞的毒性效應與機制

劉曉寧，耿 薔，徐江垚，林桂淼，王曉梅，郭遂群

(1．南方醫科大學第三附屬醫院婦產科，廣東廣州 510600；2．深圳恒生醫院生殖醫學科，廣東 深圳 518100；3．深圳大學醫學部國際腫瘤中心，廣東 深圳 518055)

量子點(quantum dots，QDs)亦稱作半導體納米晶體，是一種三維尺度均在2~10 nm的半導體納米熒光顆粒，不僅具有光穩定性好、抗光漂白，具有寬吸收窄發射及高生物相容性[1]等優良特性，而且熒光強度高、特異性強，可用于生物分子的多色標記，亦可實現單分子示蹤，其表面還能作相應修飾以獲得良好的生物相容性，故在生物學和醫學領域具有廣泛的應用[2-3]，尤其在單分子標記、靶蛋白示蹤等活體成像中更具有應用前景，但其生物安全性尚不清楚，尤其是對人體卵母細胞的影響尚缺少報道，本課題組前期觀察量子點對小鼠卵母細胞的毒性效應，發現其主要進入顆粒細胞發揮作用[4-5]。因人卵母細胞的特殊稀缺性與倫理限制而很難直接觀察其毒性，顆粒細胞通過細胞質穿過透明帶與卵母細胞膜形成縫隙連接，為卵母細胞提供營養。卵母細胞與顆粒細胞的雙向信息交流及新陳代謝物質傳遞主要通過縫隙連接蛋白43和連接蛋白45 進行[6]?？p隙連接的變化可改變卵母細胞成熟狀態[7]。本研究采用人超排卵母細胞周圍的卵顆粒細胞進行體外原代培養，檢測聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修飾的CuInS2/ZnS 量子點(非鎘量子點)對顆粒細胞的毒性效應，間接反映納米材料對人卵母細胞的毒性效應，為CuInS2/ZnS 量子點在臨床應用中的生物安全性評估提供信息。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

CuInS2/ZnS量子點(Najing Tech公司)；透明質酸酶(Sigma 公 司)； TUNEL Assay 試 劑 盒-FITC 熒 光(Colorimetric，Abcam)；Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒(DOJINDO公司)；CCK-8試劑盒及人卵顆粒細胞內的丙二醛(malondialdehyde，MDA)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、還原型谷胱甘肽(glutathione， GSH) 與谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)均為國產檢測試劑盒；總RNA 提取試劑盒(成都福際生物公司)；Taq Master Mix(Gene Solution 公 司)；SYBR?Green PCR Master Mix(TaKaRa Bio 公司)；GoScript 逆轉錄試劑盒(Promega)； 雌 二 醇(E2)/孕 酮(P4) 試 劑 盒(Roche Diagnostics公司)。

主要儀器包括：三氣培養箱(ASTECAPM50D 公司)；超凈工作臺(江蘇安泰)；單人IVF 工作站(STERILE181ICSIHIMAC 公 司)；離 心 機(Eppendorf 公司)；體視顯微鏡(日本，SZX10 公司)；實時熒光定量PCR 儀(Applied Biosystems 公 司)；流 式 細 胞 儀(BD 公司)；酶標儀(MD公司)。

1.2 體外獲取人卵巢顆粒細胞及原代培養

收集2020 年6 月—2020 年8 月在深圳恒生醫院生殖中心行體外受精/卵泡漿內單精子顯微注射(IVF/ICSI)的不孕癥患者13例超排卵，迅速將吸出的卵泡液及沖洗液倒入培養皿中，用吸管吸出可見的卵丘-卵母細胞復合體(oocyte-corona-cumulus complex，OCCs)放入培養液中，示意圖見圖1A。在培養箱中培養2~4 h后用透明質酸酶消化OCCs，收集顆粒細胞用于實驗研究。所有研究對象均自愿參加，本研究獲深圳恒生醫院倫理委員會批準(倫理批準編號HSYY-SZ-2019-001)及生殖醫學倫理委員會批準(生殖倫理批準編號HSYY-SZ-2019-002)通過后采集人體樣本，所有患者均已簽署知情同意書。

將上述人卵顆粒細胞收集至離心管，加入M199培養基4 mL，并以1 500 r/min離心5 min。用培養基洗滌兩次，棄去上清液，添加含20% FBS 的M199 培養基重懸，將其接種在培養皿中，然后置于37 °C、CO2體積分數為5%的培養箱中進行靜態培養備用。

1.3 實驗分組設計與量子點表征

將顆粒細胞分離并置于單獨培養皿中，待細胞貼壁后分組培養：設立PBS 對照組，CuInS2/ZnS 量子點低(1 μg/mL)、中(10 μg/mL)、高(100 μg/mL)3 個劑量組，培養示意圖見圖1B。使用動態光散射法測量CuInS2/ZnS 量子點的流體動力學直徑和Zeta 電位。圖1C顯示CuInS2/ZnS量子點的平均流體動力學直徑約為14~17 nm。圖1D 顯示CuInS2/ZnS 量子點的代表性透射電子顯微鏡圖像，CuInS2/ZnS 量子點的Zeta 電位約為-13.52 mV。圖1E 顯示CuInS2/ZnS 量子點的消光和光致發光光譜，量子點的發射峰約為610 nm。

圖1 實驗設計示意圖與量子點表征

1.4 CCK-8法檢測顆粒細胞活力

采用陽性對照藥物5-Fu驗證顆粒細胞對毒性檢測的靈敏性。用透明質酸酶消化志愿者卵母細胞上的顆粒細胞后，將顆粒細胞分離并轉移到單獨的培養皿中。細胞貼壁后，分別將不同濃度的5-Fu添加到培養基中。在顆粒細胞貼壁后，將5-Fu 設置7 個濃度(0.031 6、0.1、0.316、1、3.16、10 和31.6 μmol/L)梯度加入細胞培養基中，24 h后檢查細胞活力計算半數活性抑制濃度(IC50)。隨后顆粒細胞體外培養1~6 d，使用CCK-8法動態檢測細胞存活變化，確定原代培養顆粒細胞狀態，為后續毒性檢測確定最佳時間。并檢測CuInS2/ZnS 量子點處理48 h 后人卵顆粒細胞的IC50。細胞活力檢測按CCK-8 試劑盒說明書進行操作，通過酶標儀測定各實驗組在450 nm 處的吸光度值計算細胞活力，每組設3 個平行樣，每次實驗重復3次。

1.5 TUNEL 法和Annexin V/PI 雙染色法分別檢測顆粒細胞凋亡

細胞分組培養后，CuInS2/ZnS 量子點處理48 h 檢測細胞凋亡情況。TUNEL 法檢測中，按照TUNEL Assay-FITC 熒光試劑盒說明書進行操作，檢測細胞DNA片段化情況。

Annexin V/PI 雙染色法檢測：調整細胞濃度為1×107/mL，取100 μL 放入檢測管中，加入5 mL PBS 洗滌，1 000 r/min 離心5 min，棄去上清，用孵育緩沖液洗滌1 次，1 000 r/min 離心5 min。棄去上清，向沉淀內加入100 μL Annexin V 標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10~15 min，沉淀細胞用孵育緩沖液洗1 次，加入PI 溶液室溫孵育20 min，避光上機檢測。

1.6 實時熒光定量PCR 檢測顆粒細胞功能相關基因表達

細胞分組培養后，CuInS2/ZnS 量子點處理48 h 收獲顆粒細胞，使用TRIzol 試劑提取總RNA。利用GoScript 逆轉錄系統(Promega，A5004)對RNA 進行逆轉錄成cDNA。設計合成顆粒細胞功能相關基因引物(見表1)，采用實時熒光定量PCR(quantitative realtime PCR，qPCR)技術檢測如下基因的表達：睪酮合成調節關鍵蛋白(steroidogenic acute regulatory，StAR)、細胞色P450 側鏈裂解酶(cytochrome P450 side chain cleavage enzyme，P450scc)，細胞色P450 芳香化酶(cytochrome P450 aromatase，P450arom)、雌激素受體α(estrogen receptorα，ERα)、雌激素受體β(estrogen receptorβ，ERβ)、 3β-羥 基 類 固 醇 脫 氫 酶(3βhydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD)、17β羥化類固醇脫氫酶(17 β hydroxylated steroid dehydrogenase17β-HSD)、 黃 體 生 成 素 受 體(luteinizing hormone receptor，LHR)、卵泡刺激素受體(follicle stimulating hormone receptor，FSHR)。在ABI 7500 DNA 實 時熒光定量PCR 儀進行檢測：95 ℃變性5 min 后30 個PCR 循環：95 ℃、1 min，58 ℃、1 min，72 ℃、1 min。隨后在SYBR Green PCR Mix 中進行定量，按2-ΔΔCT計算相對表達量。

表1 顆粒細胞功能相關基因引物序列信息

1.7 顆粒細胞分泌雌二醇與孕酮的檢測

各組細胞在量子點處理48 h 后收集細胞培養液，所有標本收集后于-80 ℃分裝凍存。送醫院檢驗科采用電化學發光免疫分析(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)法檢測細胞上清液中雌二醇(E2)以及孕酮(P)含量。

1.8 顆粒細胞氧化應激狀態檢測

分組培養顆粒細胞并接種于6 孔板內，24 h 后更換含有終濃度分別為1、10、100 μg/mL CuInS2/ZnS的培養基，繼續培養24 h 后，顆粒細胞用PBS 洗滌3次，用預冷的裂解液裂解后，于4 ℃下1 000 r/min離心15 min，保留上清液用于測定MDA、T-AOC、TSOD、GSH 與GSH-PX 的活性。分別按照試劑盒操作步驟測定，檢測結果依照說明書進行計算。

1.9 統計學分析

使用SPSS 22.0 統計軟件包進行統計分析。所有數據均用xˉ±s表示，兩組之間的差異通過兩個獨立樣本t檢驗進行分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 5-Fu驗證體外原代培養顆粒細胞的毒性敏感性

實驗結果表明，與PBS對照組相比，5-Fu可明顯抑制顆粒細胞活性(P＜0.01)。1 μmol/L 時5-Fu 對細胞活性的抑制率為(40.35±3.89)%，10 μmol/L 時活性抑制率為(85.30±4.32)%，呈現劑量-效應關系(r=0.958，P＜0.05)。5-Fu 抑 制顆 粒細 胞 生 長 的IC50值 為1.227 μmol/L(圖2A)。同時我們對0.5、1、2 μmol/L 5-Fu處理的顆粒細胞進行細胞凋亡分析，流式細胞術檢測結果表明，5-Fu處理后的顆粒細胞呈現明顯早期凋亡特征(圖2B 和C)。5-Fu 誘導的細胞凋亡率在10 μmol/L時是1 μmol/L 的2.37±1.84 倍，顯著升高，差異具有統計學意義(P＜0.01)。

圖2 5-Fu驗證體外原代培養顆粒細胞的毒性效應

2.2 CuInS2/ZnS 量子點對顆粒細胞活力和凋亡率的影響

在顆粒細胞貼壁后，分別將1、10、100 μg/mL CuInS2/ZnS量子點添加到細胞培養基中。從第1天到第6 天，每天動態檢查細胞活力。實驗結果表明，顆粒細胞在第3 天開始出現自發凋亡(顆粒細胞出現黃素化，圖3A)。后續實驗均在體外培養48 h 顆粒細胞功能良好狀態下進行毒性檢測。不同劑量CuInS2/ZnS 量子點作用48 h觀后顆粒細胞存活率呈現劑量依賴性下降(r=0.9631，P＜0.05)，CuInS2/ZnS 量子點對顆粒細胞的IC50值為66.72 μg/mL(圖3B)。對CuInS2/ZnS 量子點處理的顆粒細胞采用TUNEL和Annexin V/PI雙染色法流式細胞儀分別進行凋亡檢測：TUNEL凋亡測試的結果表明，CuInS2/ZnS 量子點處理后，顆粒細胞中出現明顯的DNA 片段化，并隨著劑量增加呈現增加趨勢(圖3C和D)。流式細胞儀檢測結果亦表明，CuInS2/ZnS量子點處理后的顆粒細胞呈現顯著細胞早期凋亡特征(圖3E和F)。

圖3 CuInS2/ZnS量子點對顆粒細胞活力和凋亡的影響

2.3 CuInS2/ZnS 量子點誘導顆粒細胞雌激素與孕激素釋放

排卵后顆粒細胞生物功能為分泌孕酮(P)和雌二醇(E2)，它們在生殖系統中起著非常重要的作用。CuInS2/ZnS 量子點處理后，在顆粒細胞培養基中檢測到E2和P，表明其生理功能正常。實驗結果顯示100 μg/mL CuInS2/ZnS 量子點處理后顆粒細胞大量釋放內源性E2和P 與PBS 對照組比較，E2 和P 顯著升高，差異均有統計學意義(P＜0.01，圖4A 和B)，且明顯上調FSH 受體、17β羥類固醇脫氫酶(17β-HSD)、3β羥類固醇脫氫酶(3β-HSD)、細胞色素P450 芳香化酶(P450arom)的mRNA轉錄水平(圖4C)。

圖4 CuInS2/ZnS量子點引發顆粒細胞孕雌激素釋放并上調相關基因表達

2.4 CuInS2/ZnS量子點誘導顆粒細胞氧化應激狀態

結果發現，10 和100 μg/mL CuInS2/ZnS 量子點顯著增加顆粒細胞中的ROS 含量(P＜0.05 或P＜0.01，圖5A和B)。與PBS對照組相比，1 μg/mL 量子點實驗組的顆粒細胞中氧化應激標志物的活性未發生顯著變化，而10 和100 μg/mL 量子點處理后顆粒細胞中的MDA、T-AOC 及T-SOD 活性均顯著低于對照組(P＜0.01)，100 μg/mL 量子點的GSH 活性顯著高于PBS 對照組(P＜0.01)，GSH-PX明顯低于對照組(P＜0.01)。

圖5 CuInS2/ZnS量子點處理后細胞中氧化損傷情況

3 討 論

本實驗成功進行了人類卵顆粒細胞的體外原代培養，原代培養的細胞可以保留其分泌雌、孕激素的功能特性，相關研究亦證實其體外培養的可行性[8-10]，并且對不同濃度的5-Fu 具有敏感的毒性檢測反應性，呈現明顯的劑量-反應關系，結果表明原代培養的顆粒細胞可以檢測理化因子的毒性效應，與國外相關報道一致[11-13]。但持續6 d 體外原代培養顆粒細胞發現，顆粒細胞在第3 天出現自發凋亡現象，提示細胞開始黃素化，因此，毒性檢測實驗我們控制在體外培養72 h以內開展各項檢測。利用此細胞體系，我們觀察不同濃度CuInS2/ZnS量子點作用48 h對人卵顆粒細胞的毒性效應并探索其損傷機制。

中、高劑量CuInS2/ZnS 量子點處理后，顆粒細胞中出現明顯的DNA片段化，導致細胞凋亡并呈現劑量依賴性。流式細胞術檢測結果亦表明，CuInS2/ZnS 量子點誘導細胞早期凋亡發生。已有報道發現非鎘量子點對多種細胞具有毒性作用：Chen 等[14]報道InP/ZnS量子點對鯽魚卵母細胞具有明顯毒性，本研究團隊課題組報道InP/ZnS 量子點表面不同亞基修飾后對肺癌細胞HCC-15和正常肺泡上皮細胞RLE-6TN均引發明顯凋亡，濃度在20~80 μg/mL 范圍內的量子點可以引起細胞損傷，增加壞死細胞的數量，顯著降低細胞活力，并表現出明顯的劑量-效應關系[15]。本實驗發現顆粒細胞IC50為66.72 μg/mL，結果與上述報道結果基本一致。

顆粒細胞受損后可以釋放內源性激素，本實驗結果顯示高劑量組量子點明顯促進顆粒細胞雌二醇和孕酮的釋放，與量子點損傷激活并上調FSH 受體、17β羥類固醇脫氫酶(17β-HSD)、3β羥類固醇脫氫酶(3β-HSD)、細胞色素P450 芳香化酶(P450arom)的mRNA 轉錄水平密切相關，Du等[12]發現甲基醚通過抑制細胞色素P450芳香化酶功能可以抑制人卵顆粒細胞雌激素生物合成，本實驗發現量子點可以激活細胞色素P450芳香化酶功能促進雌激素合成與釋放，其可能的分子機制有待后續深入研究。

氧化損傷主要是由ROS產生增加引起的。本研究顯示CuInS2/ZnS 量子點處理后，具有促進顆粒細胞產生ROS 的能力，亦有文獻報道了InP/ZnS 量子點明顯增加肺癌細胞內ROS 含量[13]。當ROS 的產生超過人體的抗氧化能力時，將嚴重影響細胞的正常功能，并可能導致蛋白質氧化損傷、酶失活、脂質過氧化和DNA鏈斷裂。為了抵消ROS的毒性作用，細胞啟動由酶促反應和非酶促反應組成的抗氧化系統進行防御。還原型谷胱甘肽(GSH)是抗氧化系統的重要組成部分，其過度氧化和細胞中總谷胱甘肽濃度的降低可能是導致人體抗氧化能力下降的原因。GSH-PX 具有將體內過量的過氧化物還原為無毒的羥基化合物和H2O，從而降低氧化毒性。MDA是主要的脂質過氧化產物，其含量的變化可用作判斷自由基對人體損害程度的標準。本實驗發現用量子點處理的人卵顆粒細胞中ROS的產生量顯著增加，并表現出劑量依賴性，表明量子點進入細胞后存在氧化應激的產生。CuInS2/ZnS 量子點暴露使MDA 含量顯著增加，并且中(10 μg/mL)、高(100 μg/mL)劑量量子點實驗組中MDA 含量呈顯著增加趨勢，表明量子點對人卵顆粒細胞具有明顯的自由基損傷作用。暴露于100 μg/mL 量子點會導致人卵顆粒細胞中GSH 含量顯著增加，這表明當發生氧化應激時，人卵顆粒細胞會增加GSH 含量并促進其與有毒物質(量子點)的結合以防止自由基損害。SOD、CAT 和GSH-PX 是研究最多的抗氧化酶，其中SOD 主要負責去除超氧陰離子自由基，CAT主要負責過氧化氫的分解，而GSH-PX 主要負責去除H2O2和脂質過氧化物。實驗結果表明，高劑量CuInS2/ZnS量子點顯著抑制TSOD和CAT的活性，表明量子點誘導人卵顆粒細胞活性氧自由基的增加，CAT降低將引起H2O2堆積，超過T-SOD 和SOD 的清除能力而引起氧化損傷。用100 μg/mL CuInS2/ZnS 量子點處理后，人卵顆粒細胞的GSH-PX 活性明顯降低，表明GSH-PX 被抑制在一定程度上可提高過氧化水平，可見，細胞有限的修復能力不能完全解決量子點引起的毒性作用。

綜上，本實驗成功建立了體外培養的人卵顆粒細胞毒性檢測體系，CuInS2/ZnS 量子點可以通過侵入顆粒細胞導致氧化損傷發生細胞凋亡，其毒性的分子機制有待更深入研究。

致謝：感謝深圳恒生醫院生殖醫學科實驗室所有成員收集標本，感謝深圳大學(西麗校區)儀器分析中心提供的幫助。