貝母素甲影響肝癌細胞生物學行為研究

陳萬松，熊 偉，熊 書

(重慶三峽醫藥高等?？茖W校基礎醫學部，重慶 404120)

肝癌是一種發生于肝臟的惡性腫瘤，具有極高的死亡率。目前，治療肝癌主要有手術治療、化療、放療、中藥治療和生物治療等方法，其中手術治療、放療、化療效果遠遠不盡人意。中藥治療可以改善患者體征，減輕放化療的毒副作用，提高生存率和生存質量。貝母是貝母屬植物的鱗莖，干燥入藥，是川產道地貴細藥材之一，因其獨特的化痰止咳、清熱潤肺和散結消癰效果而馳名。貝母的主要活性單體為皂苷、糖苷、甾體生物堿和萜類等[1]?，F代藥理研究顯示，貝母中的生物堿貝母素甲具有抗腫瘤活性，可抑制多種腫瘤細胞的生長[2-3]。綜合結果表明，貝母素甲可作為一種全新的抗癌候選藥物，但是貝母素甲對肝癌細胞的抑制活性尚未見報道。通過研究貝母中貝母素甲抑制肝癌細胞的增殖、生長及相關機制，以期為后續應用于臨床提供可靠的藥理依據。

1 材料與方法

1.1 材料

A組：含1 μmol/L貝母素甲的培養基；B組：含2.5 μmol/L貝母素甲的培養基；C組：含5 μmol/L貝母素甲的培養基；D組：含7.5 μmol/L貝母素甲的培養基；E組：含10 μmol/L貝母素甲的培養基。

1.2 儀器

CO2培養箱(德國Heraeus公司生產)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司生產)；多孔酶標儀(美國Bio-RAD公司生產)；流式細胞儀(美國B D公司生產)。

1.3 實驗方法

1.3.1 MTT法評價貝母素甲對肝癌HepG 2細胞增殖的影響

96孔板培養HepG 2細胞24 h后去培養基，A、B、C、D和E組每孔分別加入含不同濃度的貝母素甲培養基100 μL，對照組每孔加入不含貝母素甲的培養基100 μL，空白組每孔只加不含細胞與貝母素甲的培養基100 μL，每個組設8個復孔。接種完畢后，分別培養24 h、48 h和72 h，棄上清，每孔再加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37℃、5% CO2孵育4 h。每孔再加入三聯液100 μL，37℃混勻后過夜放置。將藍紫色產物formazan溶解，酶標儀570 nm測定吸光度值。

1.3.2 貝母素甲對肝癌HepG 2細胞周期的影響

將對數生長期的HepG 2細胞貼壁生長至70%融合，置于無血清的RPMI-1640培養基中饑餓培養4 h，再分別加入含1 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、7.5 μmol/L和10 μmol/L的貝母素甲培養基處理72 h，以未加藥物處理的組為對照組。HepG 2細胞離心后，70%乙醇固定殺死細胞，4℃下放置4 h，加入RNaseA去除RNA，37℃水浴30 min，加入800 μL PI染色液，流式細胞儀488 nm波長檢測。

1.3.3 貝母素甲對肝癌HepG 2細胞凋亡的影響

將對數生長期的HepG 2細胞貼壁生長至70%融合，更換無血清的RPMI-1640培養基饑餓培養4 h，再分別加入含1 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、7.5 μmol/L和10 μmol/L的貝母素甲培養基處理72 h，以未加藥物處理的組為對照組。根據Annexin V-PI 凋亡試劑盒操作，流式細胞儀檢測。

2 實驗結果

2.1 體外MTT法評價貝母素甲對肝癌細胞HepG 2增殖的影響

貝母素甲對HepG 2細胞的影響見表1。結果顯示：藥物刺激后，C、D和E組與對照組相比有明顯差異；隨著貝母素甲濃度的增大，其對細胞的抑制作用逐漸加強，提示高濃度的貝母素甲對HepG 2細胞有一定的毒性作用。除此之外，藥物處理時間越長，對肝癌細胞的影響越大。

表1 不同濃度貝母素甲對肝癌HepG 2細胞增殖的影響Tab.1 Effects of different concentrations of Peimine on proliferation of hepatocellular carcinoma HepG 2 cells

2.2 貝母素甲對肝癌HepG 2細胞周期的影響

經過定量分析的結果顯示，1 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L貝母素甲3個處理組細胞周期分布與對照組相比，G0G1期與S期均沒有明顯改變(P>0.05)，7.5 μmol/L和10 μmol/L貝母素甲處理組細胞G0G1期占比顯著多于對照組(60.83±3.50%，63.53±2.43% vs 49.86±3.50%，P<0.05)而7.5 μmol/L和10 μmol/L貝母素甲處理組處于S期的占比顯著少于對照組(表2)。表明≥7.5 μmol/L貝母素甲處理HepG 2細胞使G0G1占比增加，表明細胞被阻滯在G0G1期，進而使細胞的分裂被阻止。

2.3 貝母素甲對肝癌HepG 2細胞凋亡的影響

早期凋亡分析發現，5 μmol/L、7.5 μmol/L和10 μmol/L貝母素甲早期凋亡百分比依次增大。晚期凋亡分析表明，對照組、2.5 μmol/L、5 μmol/L、7.5 μmol/L和10 μmol/L貝母素甲組晚期凋亡百分比依次增大，從2.5 μmol/L貝母素甲組開始后的4組早期凋亡百分比均與1 μmol/L貝母素甲和對照組有顯著性差異，說明貝母素甲濃度的增大會增加細胞的早期凋亡(表3)。晚期凋亡中，7.5 μmol/L和10 μmol/L貝母素甲與前面幾組有顯著性差異，說明≥10 μmol/L貝母素甲出現較強的毒性，誘導細胞發生凋亡和壞死。

表2 不同濃度貝母素甲對肝癌HepG 2細胞周期的影響Tab.2 Effects of different concentrations of Peimine on cycle of hepatocellular carcinoma HepG 2 cells

表3 不同濃度貝母素甲對肝癌HepG 2細胞凋亡的影響Tab.3 Effects of different concentrations of Peimine on apoptosis of hepatocellular carcinoma HepG 2 cells

3 討論

1983年，Mosmann創立了MTT比色法并第一次應用IL-2等細胞因子處理大鼠淋巴細胞瘤細胞并研究對其增殖的影響[4]，隨后迅速推廣，廣泛用于細胞實驗[5]。貝母素甲是一種生物堿，對肺癌細胞有所抑制，但是對于肝癌細胞暫未有所記載。研究貝母素甲對HepG 2細胞增殖的影響，不僅能為臨床上溫和的方式治療肝癌有所幫助和補充，還能夠為研究其對HepG 2細胞周期、凋亡、遷移等方面作濃度參考。實驗發現，高濃度的貝母素甲對HepG 2細胞有一定的毒性作用。

G0/G1期是細胞分裂的重要時期，當G0/G1期細胞占比降低，則處于細胞分裂期的細胞降低，從而引起S期和G2/M期細胞的數量降低，導致細胞周期阻滯或延長，DNA合成不足，影響細胞代謝、生長、增殖等，最終誘發凋亡機制，導致細胞凋亡。結果表明，貝母素甲使HepG 2細胞周期阻滯在G0G1期，從而阻止細胞分裂。

Annexin V/PI雙染法是一種常見的細胞凋亡熒光檢測方法。Annexin V與磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)有較強的親和力，但PS存在于細胞膜內側，只有在細胞發生早期凋亡時才會翻轉到外側，Annexin V能與外翻的PS結合[6]。碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是一種核酸染料，只有在細胞凋亡晚期和細胞壞死時才能進入細胞，使細胞核染色。Annexin V是早期反應而PI 是晚期反應，因此兩者結合使用可區分不同時期的凋亡現象。結果表明，貝母素甲誘導HepG 2細胞發生凋亡和壞死。