核酸負載納米金的改良ELISA高靈敏檢測平臺的構建*

程 易，馬粵婷，吳日紅，徐 瑜，楊舒凌，王永霞

海南醫學院教育部熱帶病重點實驗室，海南海口 571109

酶聯免疫吸附試驗(ELISA)是20世紀70年代發展起來的一種新型免疫檢測技術，其測定原理是基于抗原與抗體的特異性結合反應及酶催化底物的高效放大作用，實現對目標分子的高靈敏檢測[1-2]。由于操作簡便、快速、特異性好、檢測成本低且不需要復雜設備等，ELISA是目前臨床和科研實驗室應用最為廣泛的免疫分析技術之一[3-4]。但傳統ELISA由于酶標抗體上標記的酶分子數量有限導致檢測靈敏度不高，傳統ELISA只能檢測水平大于10-12mol/L的目標物質，但在惡性腫瘤、感染、自身免疫疾病及超敏反應性疾病的早期階段，大部分目標分子水平為10-16～<10-12mol/L，傳統ELISA難以檢測[5-7]。納米金(AuNPs)因顆粒小、比表面積大、生物相容性好逐漸成為生物醫學領域的研究熱點[8-9]。本研究擬將AuNPs作為信號放大載體，通過金-硫鍵結合生物素化DNA(DNA-B)，構建納米金生物素化DNA(AuNPs@DNA-B)信號探針，將該探針借助生物素-親和素的高親和力結合于檢測抗體上，實現信號高效放大的目的，并選擇血清含量極低、易引起過敏性疾病的抗體免疫球蛋白(Ig)E作為目標分子，驗證該檢測平臺的信號放大效果。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 全功能微孔板檢測酶標儀(BioTek Synergy H1)購于美國伯騰儀器有限公司；P9紫外-可見分光光度計購于上海美譜達儀器有限公司；高分辨率透射電鏡(JEM 2100)購于日本電子株式會社；高速冷凍離心機(Microfuge?20R)購于貝克曼庫爾特(美國)股份有限公司；電熱恒溫培養箱(BPX-162)購于上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；搖床(SLK-O3000-S)購于上海珂淮儀器有限公司。氯金酸(分子式：HAμCl4·4H2O；分析純，批號：JG9031901)購于上海思域化工科技有限公司；二水合枸櫞酸三鈉(分子式：C6H5Na3O7·2H2O，分析純)購于西隴科學股份有限公司；人IgE ELISA反應板及試劑盒購于欣博盛生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記親和素(SA-HRP)和重組鏈霉親和素(SA，分析純)購于上海碧云天生物技術有限公司；DNA-B[5′-SH-(CH2)6-TTTTTTGTCAGCCAGTGTAC-biotin-3′]由上海生工生物工程有限公司合成。0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)購于賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司。

1.2方法

1.2.1改良ELISA檢測IgE的原理 首先制備13 nm AuNPs，設計合成一段含20個堿基的DNA-B序列，其5′端經巰基化修飾，3′端經生物素化修飾，將AuNPs與DNA-B通過金-硫鍵結合形成AuNPs@DNA-B作為本實驗的信號探針。當IgE存在時，通過與微孔板上包被抗體的結合捕獲IgE，再與Ab-B結合形成夾心“三明治”結構。信號探針AuNPs@DNA-B在鏈霉親和素的輔助下與生物素化抗體結合而被固定在微孔板表面，洗滌后加入SA-HRP，以TMB和H2O2作為顯色底物，待檢物在一定水平范圍內，其水平與顯色深淺呈正相關。由于13 nm AuNPs比表面積大，DNA-B分子小、空間位阻小，每個AuNPs均可結合大量DNA-B分子，實現對檢測信號的高效放大作用，且DNA-B中的DNA分子5′端經巰基化修飾后可與AuNPs通過金-硫鍵共價結合，DNA-B分子不易脫落，背景信號較低，信噪比較高，該方法與傳統ELISA相比，可大大提高檢測靈敏度。

1.2.2枸櫞酸三鈉還原氯金酸法[10]制備13 nm AuNPs 取100 mL 0.01%氯金酸溶液在控溫攪拌器中加熱至沸騰后，邊攪拌邊加入4.8 mL新鮮配制的1%枸櫞酸三鈉。溶液由淡黃色逐漸變為深紫紅色，最后變為酒紅色，攪拌至溶液顏色不再變化，撤去熱源，繼續攪拌10 min。待溶液冷卻至室溫后恢復至原體積，4 ℃保存。采用紫外-可見分光光度計和透射電鏡對制備的AuNPs進行表征。

1.2.3制備AuNPs@DNA-B信號探針 室溫下，將一定量的100 μmol/L DNA-B加入5 mL制備好的AuNPs溶液中，置于搖床緩慢搖動(200 r/min)。期間每隔4小時依次加入2 mmol/L NaCl溶液20、45、55、65、90 μL，12 000 r/min，6 ℃離心30 min。吸出上清液后加入0.01 mmol/L(pH 7.4)的PBS重懸沉淀，洗滌2次，最后1次離心后加入5 mL 15%牛血清清蛋白(BSA)，室溫搖床搖動6 h后，12 000 r/min離心30 min，洗滌2次，沉淀儲存于4 ℃備用。采用紫外-可見分光光度計和透射電鏡對制備的探針進行表征。

1.2.4DNA-B結合AuNPs條件的優化 (1)DNA-B用量的優化。分別將2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4 μL 100 μmol/L DNA-B加入200 μL AuNPs溶液中。室溫下置于搖床搖動24 h(200 r/min)，加入2 mmol/L NaCl溶液老化探針，離心取沉淀洗滌2次后測A260。實驗重復3次。(2)DNA-B與AuNPs結合時間的優化。選擇最佳結合量的AuNPs和DNA-B，200 r/min下分別結合12、16、20、24、28、32、36、40 h，加入2 mmol/L NaCl溶液使探針老化后離心，重懸后取沉淀測A260。實驗重復3次。

1.2.5最佳反應條件的選擇 選取強陽性(4 ng/mL)的IgE標準品作為優化反應條件的待測物，生物素化抗IgE抗體(Ab-B)用量由傳統ELISA優化獲得，采用棋盤滴定法對SA、AuNPs@DNA-B復合物用量進行優化。同時將SA-HRP從1∶1 000～1∶3 000做一系列稀釋，在Ab-B、SA和AuNPs@DNA-B復合物最佳工作濃度下對SA-HRP的用量進行優化。實驗重復3次。同時設置陰性對照和空白對照。

1.2.6標準曲線的繪制 將IgE標準品從0～30 ng/mL進行一系列稀釋，分別取100 μL加入反應板中，37 ℃孵育90 min。洗滌后加入100 μL Ab-B，37 ℃孵育60 min，洗滌，加入100 μL 5 μg/mL的SA 37 ℃孵育30 min，洗滌，加入100 μL AuNPs@DNA-B孵育30 min，洗滌后加入1∶2 000 SA-HRP孵育30 min，洗滌后分別加入100 μL的四甲基聯苯胺(TMB)和H2O2，37 ℃孵育15 min。加入終止液后測定各水平的吸光度變化值(A450-A630)，經直線回歸分析，選擇最佳線性范圍作為IgE定量檢測的反應曲線。

1.2.7方法實用性研究 將IgE標準品從0.1～2.0 ng/mL用標準血清進行一系列稀釋，采用本實驗建立的改良ELISA和傳統ELISA分別檢測IgE水平，計算回收率。比較兩種方法檢測IgE時回收率的差異。回收率(%)=檢測值/實際值×100%。

2 結 果

2.1AuNPs 和AuNPs@DNA-B表征 采用紫外-可見分光光度計對制備的AuNPs、AuNPs@DNA-B進行掃描，在波長200～650 nm，扣除本底后得到如圖1A所示的光譜圖。由圖1A可見AuNPs和AuNPs@DNA-B掃描曲線波峰寬度較小，波形平滑，初步證明制備的AuNPs顆粒大小一致，分布均勻。AuNPs在標記DNA-B前，紫外吸收光譜的最大吸收峰波長在519 nm處，但標記后其最大吸收峰波長變為522 nm，出現了輕微的紅移，且在260 nm處出現了明顯的吸收峰。透射電鏡發現AuNPs的粒徑為(13±2)nm，多為球形，大小基本一致，分散均勻(圖1B)。

注：A為AuNPs及AuNPs@DNA-B紫外吸收光譜；B為AuNPs透射電鏡結果。

2.2DNA-B結合AuNPs條件的優化

2.2.1DNA-B用量的優化 當AuNPs的用量一定時，扣除背景信號后，由圖2可知，隨著DNA-B用量的增加，A260逐漸增加，尤其DNA-B用量在2.4～2.8 μL時A260急劇增加，而用量在>2.8～3.4 μL時A260增速明顯變緩，說明隨著DNA-B用量的增加，其與AuNPs的結合量亦隨之增加，直到達到其最大結合量。鑒于DNA-B在3.0～3.4 μL時A260接近最大值，且差別不大，因此本研究選用3.0 μL 100 μmol/L DNA-B 結合200 μL AuNPs作為二者后續實驗的用量。

圖2 結合AuNPs的DNA-B用量優化

2.2.2DNA-B與AuNPs結合時間的優化 在AuNPs和DNA-B最佳結合條件下，去除背景信號后，發現隨著時間的延長，A260先迅速增加后增速變緩，說明DNA-B與AuNPs的結合達到一定時間后再增加結合時間并不能增加結合效率。由圖3可知，32～40 h時A260增速緩慢，說明此時間段基本達到二者的最大結合量，因此選用36 h作為最佳結合時間。

圖3 AuNPs與DNA-B結合時間優化

2.3改良ELISA最佳反應條件的選擇

2.3.1SA和AuNPs@DNA-B用量優化 當IgE用量固定時，發現隨著SA水平和AuNPs@DNA-B用量的增加，A450逐漸增加，但當SA水平為5 μg/mL、AuNPs@DNA-B用量為100 μL時，A450接近最大值，見圖4。綜合實驗結果，SA選擇5 μg/mL作為最佳工作水平，AuNPs@DNA-B用量選擇100 μL。

圖4 SA和AuNPs@DNA-B用量優化

2.3.2SA-HRP用量優化 在最優條件下，SA-HRP稀釋度為1∶500～1∶3 000時A450下降緩慢，但超過1∶3 000則出現了明顯下降，說明稀釋度過高導致SA-HRP的用量不足，因此本研究選用1∶2 000作為SA-HRP的最終稀釋度。

2.4精密度驗證 取健康人血清及IgE陽性患者血清各10份在相同條件下重復檢測10次，批間變異系數均<6.1%，取其中1份IgE陽性血清重復測定10次，批內變異系數<2.0%。

2.5標準曲線的繪制 將IgE標準品進行一系列稀釋后，用改良ELISA檢測各水平的A值，經直線回歸分析(圖5)，得回歸方程：Y=0.139 84X+0.530 22，R2=0.983 32，發現IgE水平在0～30 ng/mL內線性關系良好，其檢測限為0.012 ng/mL。

圖5 改良ELISA檢測IgE標準曲線

2.6方法實用性研究 取IgE標準品用標準血清稀釋后，采用改良ELISA和傳統ELISA分別檢測不同水平IgE標準品，計算回收率，發現改良ELISA回收率為(99.956±0.168)%～(104.733±3.376)%，傳統ELISA為(99.100±0.529)～(100.044±0.276)%，略低于改良ELISA，但二者差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 改良和傳統ELISA測定IgE的回收率

3 討 論

隨著納米技術的發展，納米材料在生物醫學領域的應用備受關注[11]。納米顆粒因具有較大的比表面積、量子尺寸效應以及與生物材料的高度相容性逐漸成為生物醫學領域的研究熱點[12-13]。AuNPs(1～100 nm)是微小的金顆粒，又稱膠體金[14-15]。其具有高電子密度、介電特性和一定的催化作用，低毒且能與多種生物大分子結合，在醫學治療和檢測領域應用廣泛[16-17]。本研究將生物素化的DNA探針通過金-硫鍵結合于制備好的(13±2)nm的AuNPs上用于解決傳統ELISA放大效果不佳的問題，構建了基于AuNPs的IgE檢測改良ELISA。即在ELISA檢測IgE的基礎上將生物素化抗體與鏈霉親和素結合，洗滌后鏈霉親和素后再與AuNPs@DNA-B探針結合。由于每個AuNPs@DNA-B可與多個SA-HRP分子結合，加入TMB后使檢測信號進一步放大。DNA探針長度的選擇參考文獻[18-19]，20 nm以下的AuNPs負載DNA探針的長度多在15～70 nt，由于本研究所用的AuNPs粒徑較小，DNA探針的長度選擇了20 nt(另含6個CH2基團)。

紫外-可見分光光度計對制備的AuNPs進行掃描，發現其最大吸收峰波長在519 nm處，峰寬度較小，波形平滑，說明制備的AuNPs大小一致，分散性好；透射電鏡發現AuNPs粒徑為(13±2)nm，呈球形。標記DNA-B后最大吸收峰波長出現了約3 nm的紅移，且在260 nm處出現了吸收峰，說明DNA-B成功連接在了AuNPs上。未標記核酸的AuNPs與標記核酸的AuNPs光譜曲線形態基本一致，峰形變化不大，表明DNA-B標記后的AuNPs仍保持良好的穩定性。對DNA-B的用量及與AuNPs的結合時間優化發現：200 μL的AuNPs結合3.0～3.4 μL 100 μmol/L的 DNA-B時A260接近最大值，因此本研究選用3.0 μL 100 μmol/L DNA-B 作為200 μL AuNPs的最佳結合量；二者結合時間在32～40 h時A260接近峰值，本實驗選擇36 h作為二者的結合時間。通過對改良ELISA的最佳反應條件優化，發現當SA水平達5 μg/mL、AuNPs@DNA-B用量達100 μL以上時，A450接近最大值，因此選擇5 μg/mL的SA作為最佳工作水平，AuNPs@DNA-B用量選擇100 μL；同時在SA和AuNPs@DNA-B最佳用量條件下對SA-HRP用量進行了優化，發現SA-HRP稀釋度超過1∶3 000時A450迅速下降，說明稀釋度過高導致SA-HRP的結合容量不足，因此本研究選用1∶2 000作為SA-HRP的最終稀釋度。將IgE標準品進行一系列稀釋，用本實驗構建的改良ELISA檢測各水平的A450，發現IgE水平在0～30 ng/mL時，A450與IgE呈現良好的線性關系，回歸方程：Y=0.139 84X+0.530 22，R2=0.983 32，其檢測限為0.012 ng/mL，較傳統ELISA的檢測限(0.24 ng/mL)高約19倍。該平臺檢測的批內變異系數<2.0%，批間變異系數<6.1%，通過比較兩種方法對不同水平IgE標準品的回收率，發現改良ELISA回收率稍高于傳統ELISA，但二者差別不大。另外，本方法與其他常用方法相比，其靈敏度遠高于傳統的免疫印跡法，與化學發光法相近，但低于放射免疫法和熒光免疫法[20]。而放射免疫法除易造成放射性污染外，其與熒光免疫法均需要昂貴的儀器和試劑，難以在基層開展。

綜上所述，筆者通過AuNPs@DNA-B探針借助生物素-親和素間的高親和作用，構建了改良的ELISA檢測平臺，大大提高了檢測靈敏度，有較好的應用前景，為抗原/抗體的高靈敏檢測提供了參考。