血清miR-520d-3p和miR-627檢測在創傷性腦損傷診斷及預后監測中的臨床價值*

閆 靜，李 全，李丹丹，季明德△

1.南京中醫藥大學附屬醫院檢驗科，江蘇南京 210029；2.南京大學附屬金陵醫院檢驗科，江蘇南京 210002

創傷性腦損傷(TBI)的發病率正逐年上升，在年輕人及兒童中尤為突出。重度創傷性腦損傷(sTBI)的高致死率、高致殘性嚴重影響人類的生命健康和生活質量。盡管絕大多數輕度創傷性腦損傷(mTBI)患者傷后無須治療，但部分患者會持續進展為腦震蕩綜合征，并在認知、行為、精神等方面表現出不同程度的功能障礙[1]。目前臨床上主要依靠患者的臨床癥狀、體征、影像學檢查，如電子計算機斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)、單光子發射計算機斷層成像術(SPECT)和實驗室檢查[神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、鈣結合蛋白B(S100B)、微管相關蛋白Tau、髓鞘堿性蛋白(MBP)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)]等對TBI進行診斷，然而這些檢測方法在sTBI的療效評估與預后評估方面存在不同程度的局限性，并且針對影像學表現正常的mTBI患者，大部分實驗室檢查指標的敏感性極低，給mTBI的判定帶來一定的困擾[2]。因此，目前迫切需要尋找一種簡便、特異的新型生物標志物判斷TBI患者的病情、療效及預后情況，這對mTBI患者能夠及時進行診斷、治療具有重要的臨床意義。

微小核糖核酸(miRNA)是一類內源性高度保守的非編碼單鏈小RNA，在轉錄后調控基因表達，參與調控多種生物學過程[3]。目前，多項研究顯示TBI患者血清miRNA表達水平發生明顯變化，miRNA具有潛在的生物學診斷價值[3-6]。因此，本研究旨在對不同嚴重程度TBI患者及其治療前后血清miR-520d-3p和miR-627的表達水平進行分析，探討其與預后的關系，以期為TBI的診斷、療效評估、預后監測提供新的方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2014年7月至2017年7月在南京大學附屬金陵醫院確診的134例TBI患者及67例健康對照者(健康對照組)納入研究。健康對照組中男54例、女13例，年齡(49.30±11.82)歲。采用格拉斯哥昏迷指數評分(GCS)系統，將GCS>12分的TBI患者納入mTBI組(67例)，其中男48例、女19例，年齡(45.67±15.13)歲；GCS≤8分的TBI患者納入sTBI組(67例)，其中男54例、女13例，年齡(49.22±11.80)歲。TBI患者納入標準:(1)頭顱創傷24 h以內;(2)近期無其他手術史及藥物治療史。另外，所有TBI患者于傷后6個月利用格拉斯哥預后等級評分(GOS)進行預后評價，將GOS≤3分的患者作為預后差組，GOS>3分的患者作為預后好組。本研究的所有研究對象均知情同意，且得到倫理委員會批準(文件號：2015NZGKJ-019)。3組研究對象的年齡、性別、舒張壓、收縮壓比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 3組研究對象的一般資料比較

1.2儀器與試劑 采用上海醫療器械公司的高速離心機分離血清；檢測儀器為美國Applied Biosystems(ABI)公司的7300型PCR儀；提取RNA的試劑采用索萊寶公司的酸性水飽和酚和上海國藥集團試劑公司的分析純級氯仿、異丙醇、無水乙醇；RNA保存于DEPC處理水(美國Sigma公司)中；反轉錄及實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)體系所用試劑購自大連TaKaRa公司；miR-520d-3p和miR-627探針及人工合成的peu-miR-2911購自美國ABI公司。

1.3方法

1.3.1標本采集與處理 采用真空采血促凝管收集健康對照者的清晨空腹血(禁食12 h以上)和TBI患者(入院時首次采集，以及經2～8周治療后采集，病情好轉者出院當日再次采集)的空腹靜脈血標本3.5 mL。所有受試者的血標本均離心后取上層血清，并置于-80 ℃保存備用。

1.3.2血清miR-520d-3p和miR-627表達水平測定 采用Trizol提取法提取血清中的總RNA。通過反轉錄反應體系及TaqMan探針將miR-520d-3p和miR-627分別反轉錄為cDNA，反應條件為16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。采用ABI 7300 qRT-PCR系統進行擴增反應，反應條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環。以miR-2911作為外參，在標本提取過程中加入20 μL 106 fmol/L miR-2911(5′-GGCCGGGGGACGGGCUGGGA-3′)，監測標本提取過程，并將待測miRNA與miR-2911同時檢測。擴增結束后根據擴增曲線設定統一閾值，用儀器自帶的分析軟件分析擴增曲線，獲得待測miRNA與miR-2911的Ct值，miR-520d-3p和miR-627的表達水平采用相對定量法(2-ΔCt，ΔCt=CtmiRNA-CtmiR-2911)進行計算。為了降低誤差，每次實驗設3個復孔，結果取平均值。

2 結 果

2.13組血清miR-520d-3p和miR-627表達水平比較 qRT-PCR檢測結果顯示，與健康對照組相比，mTBI組和sTBI組患者血清miR-520d-3p和miR-627表達水平均明顯升高，且sTBI組患者血清miR-520d-3p和miR-627表達水平明顯高于mTBI組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組血清miR-520d-3p和miR-627的表達水平比較[M(P25,P75)]

2.2TBI患者治療前后血清miR-520d-3p和miR-627表達水平比較 分析所納入研究的TBI患者入院時及經2～8周治療后的血清miR-520d-3p和miR-627的水平變化，qRT-PCR檢測結果顯示，與治療前相比，治療后患者的miR-520d-3p和miR-627表達水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 TBI患者治療前后血清miR-520d-3p和miR-627表達水平比較[M(P25,P75)]

2.3不同預后的TBI患者血清miR-520d-3p和miR-627表達水平比較 預后差組37例，預后好組97例。結果顯示，與預后好組相比，預后差組的miR-520d-3p和miR-627表達水平明顯較高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同預后的TBI患者血清miR-520d-3p和miR-627表達水平比較[M(P25,P75)]

2.4TBI患者血清miR-520d-3p和miR-627表達水平的診斷價值 繪制ROC曲線，分析血清miR-520d-3p和miR-627對TBI的診斷效能。結果顯示，血清miR-520d-3p診斷mTBI的AUC為0.866(95%CI:0.800～0.933，P<0.05)，診斷sTBI的AUC為0.913(95%CI:0.813～0.965，P<0.05)，鑒別診斷mTBI與sTBI的AUC為0.622(95%CI:0.527～0.718，P<0.05)，見圖1A。血清miR-627診斷mTBI的AUC為0.832(95%CI:0.763～0.903，P<0.05)，診斷sTBI的AUC為0.890(95%CI:0.839～0.946，P<0.05)，鑒別診斷mTBI與sTBI的AUC為0.651(95%CI:0.558～0.743，P<0.05)，見圖1B。

注：A為miR-520d-3p；B為miR-627；1為區分mTBI患者與健康對照者；2為區分sTBI患者與健康對照者;3為區分mTBI與sTBI患者；4為參考線。

3 討 論

臨床上判定TBI的首選檢查方法是CT，但其敏感性較低，尤其是大部分mTBI患者的影像學表現無異常變化，臨床醫生僅能根據經驗和GCS進行判斷，難以準確判定mTBI。盡管MRI可以提高對微小病灶的檢出率，但費用昂貴，患者難以負擔，限制了其的推廣和應用。目前已知的實驗室大分子蛋白標志物對于TBI的診斷缺乏特異性[4]。因此，尋找一種新型、特異的生物標志物顯得尤為重要。

miRNA具有高度保守性、時序性和組織器官特異性，且可調節人體各個系統的生理功能及參與疾病的發生、發展[5]。目前已發現多種miRNA高表達于中樞神經系統，并參與調節神經細胞發育、分化等重要生理過程[6-7]。多項研究結果提示miRNA與TBI的嚴重程度密切相關，是診斷TBI潛在的生物標志物[2-3]。

本研究前期采用低密度芯片技術篩選出miR-520d-3p和miR-627，結合qRT-PCR技術分析、驗證兩種miRNA在不同嚴重程度的TBI患者血清中的特異性表達情況，并觀察了TBI患者治療好轉后的miR-520d-3p和miR-627表達水平變化情況。同時，結合患者出院后6個月的GOS進行綜合分析，判斷其預后情況。結果發現，miR-520d-3p和miR-627在不同嚴重程度的TBI患者血清中都呈高表達，且sTBI組的表達水平明顯高于mTBI組，提示miR-520d-3p和miR-627可能與疾病的嚴重程度密切相關。因此，有理由推測表達水平升高的miR-520d-3p和miR-627可能通過調控某種蛋白進而使顱腦損傷后的病情惡化。本研究結果提示，miR-520d-3p和miR-627可以作為TBI患者潛在的診斷標志物，尤其為影像學表現正常的mTBI的診斷提供了較大的幫助，降低漏診率。當患者病情好轉，炎癥指標基本恢復正常，腦水腫等癥狀明顯減輕后，miR-520d-3p和miR-627的表達水平也明顯下降，提示miR-520d-3p和miR-627可為療效觀察提供有效的基因學依據。另外，預后差組的miR-520d-3p與miR-627的表達水平明顯高于預后好組，提示miR-520d-3p和miR-627的表達水平與預后密切相關，可以作為TBI患者預后判斷的敏感指標。鑒于此，筆者推測血清miR-520d-3p和miR-627可能參與TBI病理過程的發生、發展，當腦組織受損時，神經細胞主動或被動釋放miR-520d-3p和miR-627，并通過血腦屏障釋放到血液中，本課題組也會在后續開展相關機制的研究。

ROC曲線分析顯示，血清miR-520d-3p和miR-627不僅可以較好地區分健康人和sTBI患者，對健康人和mTBI患者也有較好的區分作用。同時對mTBI和sTBI也具有一定的鑒別診斷能力。由此可見，miR-520d-3p和miR-627不僅反映顱腦損傷的嚴重程度，對評估療效和預后有重要意義，而且還可作為TBI潛在的診斷標志物。

TBI的發病機制非常復雜，目前相關報道常涉及神經細胞凋亡、炎性反應、可塑性改變等[8]。研究發現，miR-520d-3p和miR-627在神經系統性疾病中發揮著重要的生理、病理作用。DESHPANDE等[9]證實，miR-520d-3p通過靶向抑制信號調節蛋白α的表達，進而促進星形膠質細胞惡性程度的升高，提示miR-520d-3p可作為星形細胞瘤的診斷標志物。FAN等[10]發現，miR-627通過靶向NR2C2蛋白調控神經膠質細胞瘤的惡化。然而，目前較缺乏miR-520d-3p和miR-627在TBI發病機制中的研究。本課題組后續將在動物與細胞水平上開展機制研究，以期為TBI的診斷、治療提供理論依據。