刺梨果粉緩解過度訓練大鼠骨骼肌氧化應激損傷效果的研究

張帥軍，唐月梅，張大鼎，張 錦

（1.贛南師范大學科技學院，江西贛州 341000；2.平頂山市第一人民醫院，河南平頂山 467000）

氧化應激 （oxidative stress，OS）是指體內氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態[1]。氧化應激作用下，組織細胞內的核酸、蛋白質和脂質等生物分子發生交聯、滅活、從而引起膜損傷以及一些生理生化過程的紊亂[2-3]。刺梨[4]（Rosa roxburghiiTratt） 系薔薇科落葉灌木刺梨的果實，是一種天然的藥食兩用植物，在《本草綱目》和《中藥大辭典》中均有收載，其果肉脆、酸甜，富含維生素C、維生素B、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、多糖以及多種人體必需的氨基酸，果皮富含黃酮和酚類等物質。研究顯示刺梨具有抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤、免疫調節、促消化等功能，曹晶晶等[5]通過水煮刺梨提取刺梨多糖，發現刺梨多糖對負重游泳小鼠具有抗疲勞作用；于麗偉等[6]研究刺梨果汁對拘束負荷誘發小鼠肝損傷具有一定的保護作用；夏星等[7]研究刺梨提取物可增加機體糖原儲備，顯著增強小鼠的抗疲勞和耐缺氧能力；周禹佳等[8]研究刺梨果渣具有豐富的營養成分和保健價值。近些年來隨著對刺梨研究開發的深入，其抗氧化應激的功能越來越突出。

運動訓練是為了提高競技能力和運動成績，專門組織的有計劃的體育活動，隨著社會的發展，競賽水平的提高，運動訓練的強度越來越大，對運動員來說存在過度訓練的風險，可引發機體功能紊亂或病理狀態，嚴重影響運動成績的發揮。為減少過度訓練對骨骼肌造成的氧化應激損傷，較多研究者從不同的方向提出了緩解的措施和方法，在營養、藥物干預方面，刺梨緩解過度訓練引起骨骼肌氧化應激損傷方面的研究不多，因此本研究擬建立過度訓練的大鼠模型，通過補充不同劑量的刺梨果粉，觀察大鼠骨骼肌組織形態結構變化，檢測骨骼肌細胞損傷標志物以及氧化應激指標水平，并結合組織內核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）信號通路相關因子基因、蛋白表達以及骨骼肌細胞凋亡蛋白表達水平，探究不同劑量的刺梨果粉對過度訓練大鼠骨骼肌氧化應激損傷的保護作用，為刺梨作為藥品或功能性運動飲料的進一步開發提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級雄性SD大鼠 購自江西中醫藥大學動物實驗中心（動物生產合格證號：SCXK（贛）2018-0003）。體質量（236.78±1.21） g，7周齡，飼養于（22±2） ℃、相對濕度（60%±5%）的環境中，自由飲食，喂食國家標準嚙齒類動物飼料，正常晝夜節律；刺梨果粉 陜西盛恒生物有限公司，由甄選于當年9～10月份貴州烏蒙山上圓形飽滿、色澤金黃的成熟果實，晾干研磨而成；肌酸激酶（creatine kinase，CK）試劑盒 東軟威特曼生物科技（南京）有限公司；血清白細胞介素-1β（inter leukin-1β，IL-1β）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒

亞諾法生技股份有限公司；SOD、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；大鼠Nrf2檢測試劑盒 北京百奧萊博科技有限公司；血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）、Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1（kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）試劑盒 亞科因（武漢）生物技術有限公司；B細胞淋巴瘤因子-2（B cell lymphoma 2 protein，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）試劑盒 上海研生生化試劑有限公司。

JD-PT動物實驗跑臺 上海繼德教學實驗器械廠；LD-96A酶標儀、LD-PCR熒光定量PCR反應儀山東萊恩德智能科技有限公司；UC0102核酸擴增儀 杭州優思達生物技術有限公司；YKY-1100熒光顯微鏡 基恩士（中國）有限公司；WD-9413B凝膠成像分析系統、DYCZ-40K轉印電泳儀 北京六一生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 灌胃溶液的配制 低濃度刺梨果粉溶液：參照何誠[9]《動物實驗學》中的方法，稱取1 g刺梨果粉溶于50 mL去離子水中，配制質量濃度為20 mg/mL的刺梨果粉溶液；高濃度刺梨果粉溶液：稱取1 g刺梨果粉溶于20 mL去離子水中，配制質量濃度為50 mg/mL的刺梨果粉溶液。

1.2.2 動物分組與模型的建立 45只SD大鼠，以10 m/min、10 min/d、坡度10°的跑臺運動方式進行篩選，剔除運動能力較差的5只，剩余40只按隨機原則，分為安靜對照組（C組，10只），運動組（HT組，10只）、低濃度刺梨果粉+運動組（L-HT組，10只）、高濃度刺梨果粉+運動組（H-HT組，10只）。參照《動物實驗學》中動物灌胃給藥量的標準，L-HT、H-HT組分別以20、50 mg/mL質量濃度的刺梨果粉溶液每天20 mL/kg的劑量灌胃，C組和HT組采用相同劑量的生理鹽水灌胃，每天灌胃一次。C組不進行運動干預，HT組、L-HT組、H-HT組采用改良后的遞增負荷跑臺運動方案[10-11]，運動干預6周，每周5 d，每次從10 m/min開始，每5 min速度增加5 m/min，直至目標速度，如果無法維持目標速度，則運動至力竭。方案見表1。

表1 大鼠跑臺運動方案Table 1 Treadmill exercise program in rats

1.2.3 血液標本采集和骨骼肌組織的提取 6周末次運動后，次日上午10:00用10%的巴比妥腹腔注射麻醉，尾靜脈取血3 mL，置于抗凝管內，4 ℃、3000 r/min，離心10 min，分離血清，分裝置于-20 ℃冰箱保存待測。

斷頭處死各組大鼠，立即取腓腸肌，置于冰浴中，剔除脂肪及周圍的結締組織，用預冷的生理鹽水沖洗血漬，待濾紙吸干后標記分裝，一份置于4%的多聚甲醛溶液中，另一份用電子天平稱重1 g，按照1:4的比例用眼科剪剪碎置于玻璃勻漿管，加入4 mL介質PBS，電動勻漿器勻漿，4 ℃、6000 r/min、10 min，取上清液分裝，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 指標測試

1.3.1 血清中骨骼肌損傷標志物的檢測 取待測血清，采用N-乙酰半胱氨酸法測定CK活性，ELISA法檢測炎癥因子IL-1β、TNF-α的水平，檢測嚴格按照試劑盒說明進行。

1.3.2 骨骼肌組織形態微結構變化的檢測 將腓腸肌從多聚甲醛中取出放入包埋盒中，流水沖洗30 min、置于不同濃度的酒精中脫水后、再置于透明劑二甲苯中滲透、然后石蠟包埋、切片、展片、烤片、脫蠟、HE染色、光學顯微鏡下觀察骨骼肌組織結構變化。

1.3.3 骨骼肌組織中氧化應激指標的檢測 取待測組織液，參照柳愛蓮等[12]《精編運動人體科學實驗指南》中的微量酶標法測定GSH的濃度，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD的活性，檢測嚴格按照試劑盒說明進行。

1.3.4 骨骼肌組織Nrf2信號通路中相關蛋白mRNA表達的檢測 RT-PCR檢測：取待測組織液，在RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制劑，搖勻置于冰水浴中沉淀，用Trizol法提取總RNA，每個樣本以2 μg RNA作為初始模板，配置20 μL的總反應體系，應用反轉錄試劑盒在逆轉錄酶的作用下反轉錄成cDNA。參照李丹等[13]設計的基因引物序列（表2）進行設計后，依照試劑盒說明配制20 μL的反應體系，每組樣本檢測3個復孔，利用兩步法進行實時熒光PCR反應，反應條件為預變性95 ℃、30 s，PCR反應95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40個循環，最后根據各反應孔的Ct值，采用2-ΔΔCT算法計算出樣本中mRNA的相對表達量。

表2 Real-time PCR基因引物序列Table 2 Gene primer sequences of Real-time PCR

1.3.5 骨骼肌組織中Nrf2信號通路和細胞凋亡相關蛋白表達的檢測 Western Blot檢測：取待測組織液，在RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制劑，搖勻置于冰水浴中沉淀，用BCA法測定各組待測液蛋白濃度，并稀釋至相同蛋白濃度，蛋白定量后加入上述混合液，100 ℃煮沸5 min，按照4:1的體積比例加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上清液5X，分離樣品并轉膜，用TBST洗滌3次后，用牛清蛋白封閉2 h，再用TBST洗滌3次，加入二抗后在室溫下孵育，用TBST洗脫二抗，用增強型化學發光試劑在WD-9413型凝膠成像系統顯影。以β-actin為內參，計算目的蛋白Nrf2、Keap1、HO-1、Bcl-2、Bax條帶的積分光密度，換算蛋白質相對表達量。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 刺梨果粉對過度訓練大鼠血清骨骼肌損傷標志物的影響

為明確是否成功建立過度訓練大鼠模型，本研究以6周遞負荷的跑臺運動進行訓練，通過對血清CK活性和炎癥因子IL-1β、TNF-α水平的變化進行分析[14]，結果顯示（表3），與C組相比，HT組血清CK活性、IL-1β和TNF-α的水平顯著升高（P＜0.01）。與HT組相比，L-HT組血清CK活性下降、IL-1β和TNF-α的水平降低（P＜0.05）；H-HT組血清CK活性下降、IL-1β和TNF-α的水平顯著降低（P＜0.01）。與L-HT組相比，H-HT組CK活性下降、IL-1β和TNF-α的水平降低（P＜0.05）。上述結果表明，過度訓練大鼠模型建模成功，且不同濃度的刺梨果粉可以有效緩解過度訓練引起的骨骼肌氧化應激損傷。

表3 各組大鼠血清中骨骼肌損傷標志物水平（n=10）Table 3 Serum markers of skeletal muscle injury of rats in each group (n=10)

2.2 刺梨果粉對過度訓練大鼠骨骼肌組織結構形態變化的影響

光鏡下觀察（圖1），C組骨骼肌組織結構完整，肌纖維排列規則，未出現變性、水腫及空泡狀等現象，細胞核均勻的分布于周邊，核仁明顯，無浸潤炎癥現象；HT組肌組織形態較C組發生異常顯著性改變，肌纖維出現空泡，間隙擴大，排列不規則，連接處出現組織嚴重炎癥浸潤，核仁排列雜亂；L-HT組肌組織形態學變化較HT組有所改善，損傷炎癥程度減輕，但仍見有水腫、炎癥局部空泡現象；H-HT組肌組織形態學較HT組有較好改變，水腫、炎癥幾乎沒有，只是局部偶見細胞空泡，肌纖維排列規則、核仁明顯。光鏡下各組大鼠骨骼肌組織病理形態學變化。

圖 1 各組大鼠骨骼肌組織病理形態學變化HE染色Fig.1 HE staining of histopathological changes of rat skeletal muscle in each group

2.3 刺梨果粉對過度訓練大鼠骨骼肌組織中氧化應激指標的影響

機體內各種抗氧化酶和小分子抗氧化劑構成了機體重要的防御體系，以對抗氧化應激，保持內環境穩定[15]。各組大鼠肌組織中的GSH、SOD和MDA結果（表4）顯示，與C組相比，HT組中GSH濃度降低、SOD活性下降以及MDA含量增多，有異常顯著性統計學差異（P＜0.01）。與HT組相比，L-HT組肌組織中GSH濃度上升、SOD活性增強以及MDA含量降低，有顯著性統計學差異（P＜0.05）；H-HT組肌組織中GSH濃度上升、SOD活性增強以及MDA含量降低，有異常顯著性統計學差異（P＜0.01）。與L-HT組相比，H-HT組SOD活性升高，MDA含量降低，有顯著性統計學差異（P＜0.05）。

表4 各組大鼠骨骼肌組織中氧化應激指標 （n=10）Table 4 Oxidative stress indicators of skeletal muscle of rats in each group (n=10)

2.4 刺梨果粉對過度訓練大鼠骨骼肌組織中Nrf2信號通路相關蛋白mRNA表達的影響

mRNA是含有與DNA分子中某些功能片段相對應的堿基序列的一類單鏈核糖核酸，作為蛋白質生物合成的直接模板，指導蛋白質的合成。各組大鼠肌組織中的Nrf2、Keap1和HO-1的mRNA 表達結果（表5）顯示，與C組相比，HT組Nrf2、HO-1的mRNA相對表達水平明顯降低（P＜0.01）。與HT組相比，L-HT組Nrf2、HO-1的mRNA相對表達水平升高（P＜0.05）；H-HT組Nrf2、HO-1的mRNA相對表達水平明顯升高（P＜0.01）。與L-HT組相比，H-HT組Nrf2、HO-1的mRNA相對表達水平升高（P＜0.05）。Keap1 mRNA的相對表達量在各組間沒有變化。

表5 各組大鼠骨骼肌組織中Nrf2信號通路相關蛋白的mRNA相對表達量 （n=10）Table 5 Relative mRNA expression levels of Nrf2 signaling pathway related proteins in skeletal muscle tissue of rats in each group (n=10)

2.5 刺梨果粉對過度訓練大鼠骨骼肌組織中Nrf2信號通路相關蛋白表達的影響

Nrf2信號通路是生物體內最為重要的內源性抗氧化應激通路[16]，通過Nrf2、Keap1的結合態，調控HO-1的抗氧化作用。各組大鼠肌組織中的Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表達結果（圖2）顯示，與C組相比，HT組Nrf2表達水平顯著降低（P＜0.01）；HO-1表達水平下降（P＜0.05）。與HT組相比，L-HT組Nrf2、HO-1表達水平升高（P＜0.05）；H-HT組Nrf2、HO-1表達水平明顯升高（P＜0.01）。與L-HT組相比，H-HT組Nrf2、HO-1表達水平升高（P＜0.05）。Keap1蛋白的表達在各組間沒有變化。

圖 2 各組大鼠骨骼肌組織中Nrf2信號通路相關蛋白表達Fig.2 Expression of Nrf2 signaling pathway related proteins in skeletal muscle tissue of rats in each group

2.6 刺梨果粉對過度訓練大鼠骨骼肌組織中細胞凋亡相關蛋白表達的影響

細胞凋亡是多因素、多階段和多基因嚴格控制的過程，通過級聯反應降解底物，出現凋亡特征性的形態和生化改變。Bcl-2家族蛋白被視為調節細胞凋亡的開關，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax之間的相互作用，決定了細胞死亡的閾值[17]。各組大鼠肌組織中的Bcl-2、Bax蛋白表達結果（圖3）顯示：與C組相比，HT組Bcl-2表達水平下降、Bax表達升高、Bcl-2/Bax值下降，有異常顯著性統計學差異（P＜0.01）。與HT組相比，L-HT組Bcl-2表達水平升高、Bax表達下降、Bcl-2/Bax值增加，有統計學差異（P＜0.05）；H-HT組Bcl-2表達水平升高、Bax表達降低、Bcl-2/Bax值升高，有異常顯著性統計學差異（P＜0.01）。與L-HT組相比，H-HT組Bcl-2表達水平升高，有顯著性統計學差異（P＜0.05），Bcl-2/Bax值升高，有顯著性統計學差異（P＜0.05）。

圖 3 各組大鼠骨骼肌組織中細胞凋亡相關蛋白表達Fig.3 Expression of apoptosis-related proteins in skeletal muscle tissue of rats in each group

3 討論

3.1 過度訓練引起大鼠骨骼肌組織結構氧化應激損傷的分析

骨骼肌是機體運動系統的有機組成部分，一般情況下運動訓練引起的機體氧化應激變化在肌肉中表現得最為明顯，這種現象反應了自由基產生的組織差異以及不同組織抗氧化能力的不同。CK[18]是肌肉收縮時能量供應以及運動后磷酸肌酸再合成過程中關鍵的一種酶，生理狀態下只有少量的CK逸出。IL-1β[19]又稱淋巴細胞活化因子，是炎癥反應的重要個體，TNF-α是一種促炎癥細胞因子。血清CK和炎癥因子IL-1β、TNF-α等是間接反應骨骼肌氧化應激的一些敏感性指標，且與損傷程度呈正相關[14]。本研究中，6周遞增負荷跑臺運動后，HT組血清中CK、IL-1β和TNF-α的水平與C組相比明顯升高，同時結合光鏡下肌組織病理性形態學的變化，說明長期大強度運動能夠誘發大鼠骨骼肌出現氧化應激損傷，這與已有的長期大強度運動，容易導致局部產熱過多，引起肌肉收縮裝置改變[20]、細胞膜和內部微結構破壞[21]，出現肌肉微損傷；以及長時程、大強度運動可誘導大鼠血清CK[22]水平升高，機體炎性因子IL-1β[23]水平增加和TNF-α[24]水平升高等研究具有一致性。即再次證實了長期大強度運動能夠產生氧化應激損傷，同時也說明了實驗的設計是科學合理的。其原因可能與長期運動中肌纖維的過度牽拉以及大強度運動導致機體出現的局部高溫等有關，引起機體出現過氧化應激反應，造成骨骼肌內部收縮裝置和細胞膜的微損傷，使CK大量透過細胞膜逸出到體液中，刺激機體出現炎癥反應，產生大量的炎性因子IL-1β和TNF-α。

SOD是生物體內最重要的抗氧化酶，研究證實SOD活性越高，機體抗氧化能力就越強[25]。GSH是體內重要的抗氧化劑之一，在清除自由基及衍生物的毒性中起主要作用。MDA是脂質過氧化的產物。正常情況下機體不斷產生活性氧，但不會對機體造成嚴重損害，主要由機體內部的抗氧化防御系統發揮作用。長期大強度運動時，組織代謝率增加，耗氧量增多，產生大量的活性氧，導致自由基代謝失衡，引起一系列運動氧化應激損傷。本研究中，6周遞增負荷跑臺運動后，HT組勻漿中SOD、GSH水平明顯低于對照組，MDA含量明顯高于對照組，說明HT組骨骼肌內生成了大量的自由基，與骨骼肌細胞膜發生了大量的脂質過氧化反應，這與牛衍龍等[26]、周海濤等[27]、李影等[28]研究過度訓練引起大鼠骨骼肌氧化應激加強，引起機體出現強烈地抗氧化反應，導致SOD、GSH水平下降等研究具有一致性。其原因可能與過度訓練通過黃嘌呤氧化酶[27]、通過誘發線粒體呼吸鏈電子漏形成[29]等引起大量超氧陰離子和羥自由基的產生有關，即過度訓練中，機體需要大量的能量，能源物質在能量的轉換和轉移過程中，特別是在線粒體生物氧化過程NADHH+和FADH2中的氫，經氧化呼吸鏈將電子傳遞給氧生成水驅動ADP磷酸化合成ATP的過程中，生成大量的電子漏，漏出的電子可直接與氧作用，產生部分被還原的氧，即大量的超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等活性氧成分，引起機體抗氧化酶/劑的大量消耗。同時電子漏也可引起質子漏[30]的產生，質子漏的增多是氧化磷酸化偶聯程度下降的重要因素，即在一定程度上又促進了活性氧的形成。

3.2 過度訓練對大鼠骨骼肌Nrf2信號通路相關蛋白和細胞凋亡蛋白表達影響的分析

Nrf2信號通路是機體最為重要的內源性抗氧化應激通路，Nrf2是Nrf2信號通路上最重要的調節因子。正常情況下與其負調節因子Keap1結合，處于無活性狀態，當氧化應激增強時，活性氧異化Keap1結構域，引起Keap1變構，使其與Nrf2解離，游離的Nrf2通過與抗氧化反應元件相互作用，激活下游的抗氧化酶系統發揮作用。Bcl-2家族蛋白被視為調節細胞凋亡的開關，Bcl-2和Bax之間的平衡，決定了細胞死亡的閾值。Nrf2可通過與Bcl-2基因啟動子反向鏈上核苷酸-3 148-140之間的抗氧化反應元件結合[31]，上調Bcl-2和下調Bax的表達，減少細胞凋亡。本研究中，6周遞增負荷跑臺運動后，HT組肌組織中Nrf2轉錄活性降低、HO-1表達水平下降，抗凋亡蛋白Bcl-2水平明顯下降，促凋亡蛋白Bax水平明顯升高，說明長期大強度運動可引起Nrf2信號通路相關蛋白Nrf2、HO-1和凋亡蛋白Bcl-2、Bax表達的變化，即降低Nrf2信號通路的抗氧化應激能力和增加骨骼肌細胞的凋亡水平，這與已有的長期大強度運動后大鼠骨骼肌Nrf2表達下降，Keap1表達不明顯[32]；長期大強度運動誘導大鼠腎臟細胞HO-1表達減少，Bax表達明顯增強，Bcl-2表達明顯減少[33]；長期大強度運動誘導大鼠心肌細胞HO-1表達下降[34]等研究具有一致性。其原因可能長期的大強度運動刺激，引起機體氧化應激增強，產生大量的活性氧，觸發Nrf2信號通路活動加強，長期Nrf2信號通路活動的亢奮，引起Nrf2信號通路的超限抑制，使Nrf2、HO-1表達的下降，降低機體的抗氧化應激能力，同時機體抗氧化應激水平的下降，可導致骨骼肌細胞凋亡加快，表現為Bax表達升高，Bcl-2水平下降。

3.3 刺梨果粉緩解過度訓練大鼠骨骼肌氧化應激損傷的分析

刺梨果是一種天然的抗氧化劑，具有調節機體免疫功能、延緩衰老、抗動脈粥樣硬化和抗腫瘤等功能[35]。有研究證實刺梨在抗氧化應激方面具有較好的作用。本研究中不同濃度的刺梨果粉在6周遞增負荷跑臺運動大鼠身上呈現出不同的抗氧化能力，在骨骼肌組織微結構病理損傷方面，L-HT組、H-HT組骨骼肌組織微結構僅出現較少的炎癥反應，且HHT組的炎癥反應更不明顯，說明刺梨果粉在預防過度訓練導致的骨骼肌氧化應激損傷和炎癥產生方面具有一定的防護作用；在抗氧化應激方面，L-HT組、H-HT組勻漿中SOD活性、GSH濃度表達水平升高，MDA含量下降，且H-HT組效果好于L-HT組，說明補充刺梨果粉可以顯著提升機體對抗活性氧的能力，減少脂質過氧化，且抗氧化應激能力與刺梨果粉劑量之間存在量效關系，這與張曉玲等[36]對大強度運動大鼠連續補充刺梨，可有效保護胰臟免受四氧嘧啶氧化損傷，預防糖尿病皮膚損傷的發生發展；陳慶等[37]給予大強度運動小鼠刺梨提取物補劑，能顯著增強小鼠抗過氧化、抗疲勞和抗腫瘤能力；以及楊江濤等[38]刺梨多糖可劑量依賴性地提高衰老小鼠體內抗氧化能力等研究具有一致性。其原因可能與刺梨富含VC、VE、類胡蘿卜素、SOD和刺梨多糖等營養素有關，機體在長時間大強度應激下，代謝率升高、耗氧量急劇增加，氧供明顯不足，容易引起機體出現超氧化應激反應，為減少運動氧化應激損傷，大量的外源性抗氧化劑被利用，與自身抗氧化系統形成了級聯協作機制，共同發揮抗氧化作用，淬滅ROS或自由基，減少脂質過氧化反應，減輕損傷，起到防護作用。

3.4 刺梨果粉對過度訓練大鼠骨骼肌Nrf2信號通路相關蛋白和細胞凋亡蛋白表達的影響分析

刺梨在機體Nrf2信號通路和骨骼肌細胞凋亡方面的研究較少，本研究顯示，補充不同濃度的刺梨果粉對6周遞增負荷跑臺運動大鼠Nrf2信號通路相關蛋白和骨骼肌細胞凋亡蛋白的影響不同，LHT組、H-HT組Nrf2、HO-1和Bcl-2表達水平升高以及Bcl-2/Bax比值增加，Bax表達水平下降，且HHT組中的Nrf2、HO-1和Bcl-2表達水平以及Bcl-2/Bax比值升高的更明顯，說明了6周的刺梨果粉補充可上調Nrf2信號通路相關蛋白Nrf2、HO-1蛋白的表達，減少應激狀態下的細胞凋亡水平，提升機體的抗氧化能力，同時劑量與效果之間存在量效關系。其原因可能與刺梨果中的有機成分（黃酮、多酚）有關，有研究顯示刺梨黃酮[39]可下調心肌細胞Bax水平的表達，減少心肌細胞凋亡；黃酮可上調梗阻性腎病大鼠腎臟Nrf2與HO-1蛋白表達水平，減輕腎臟氧化應激損傷[40]；多酚可上調糖尿病腎病小鼠腎組織中Nrf2、HO-1蛋白表達水平，減少腎臟的氧化應激[41]。本實驗中刺梨在基于Nrf2信號通路發生抗氧化作用，減少骨骼肌細胞凋亡，緩解氧化應激損傷中存在級聯效應，即過度訓練的超氧化應激，導致體內活性氧增多、積累，活性氧可直接與Keap1結構域（IVR、BTB、DGR）中的IVR結合，催化IVR結構域中的半胱氨酸[32]；其次刺梨中的酚類成分——酚羥基[41]也可以直接修飾IVR結構域中的半胱氨酸殘基，共同促使IVR與BTB和Keap1形成的二聚體發生聯動，引起DGR變構，導致Nrf2與Keap1親和力下降、分離，Nrf2進入核內，對目標基因轉錄活性激活，誘導HO-1表達增加，發揮抗氧化應激作用。同時Nrf2還通過與Bcl-2基因啟動子反向鏈上的核苷酸-3的抗氧化反應元件結合[31]，上調Bcl-2和下調Bax的表達，減少細胞凋亡，預防和緩解氧化應激的發生發展。

4 結論

本實驗證實了過度訓練可引起大鼠骨骼肌產生過氧化反應，加劇細胞凋亡，引起骨骼肌損傷。6周不同濃度的刺梨果粉補充可提升過度訓練大鼠SOD活性和GSH的濃度水平，以及上調Nrf2、HO-1和Bcl-2蛋白的表達，提升抗氧化能力，減少細胞凋亡，緩解骨骼肌運動氧化應激損傷，且抗氧化應激能力與刺梨果粉補充劑量之間存在正相關，這可能與刺梨介導Nrf2信號通路發揮抗氧化反應的級聯機制有關，后期可進一步探討刺梨介導的Nrf2信號通路途徑，以期為刺梨作為藥品和功能性食品的進一步開發提供理論參考依據。