橘紅素預(yù)處理對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)成骨細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

李汁涵，陳艷莉，田 欣，路鴻瑜，殷 航，鄔 鈺，2，黃宏靚，2，陳 珺，2

（廣東藥科大學(xué)1.生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，2.生物資源與創(chuàng)新藥物研究中心，廣東 廣州 510006）

隨著社會(huì)人口老齡化趨勢(shì)加劇，增齡性疾病所引發(fā)的健康問(wèn)題愈發(fā)受到重視，骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，Op）即是其中的典型代表。Op以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞為主要特征。近年來(lái)，隨著對(duì)細(xì)胞衰老認(rèn)識(shí)的深入，靶向細(xì)胞衰老機(jī)制篩選新的防治藥物已成為應(yīng)對(duì)Op的重要思路和方法[1]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致細(xì)胞損傷并衰老的重要原因[2]，氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌、酶活性變化以及信號(hào)通路傳導(dǎo)，干預(yù)核內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，導(dǎo)致成骨細(xì)胞增殖、分化、凋亡和細(xì)胞功能的異常，進(jìn)而打破骨重建過(guò)程中的骨形成和骨吸收平衡，最終引起Op[3]。補(bǔ)充外源性抗氧化物可以明顯改善氧化應(yīng)激對(duì)骨的氧化損傷，且無(wú)明顯不良反應(yīng)，如茶多酚、白藜蘆醇和柚皮素等天然抗氧化物均已被證實(shí)具有抗骨質(zhì)疏松活性[4]。橘紅素（5，6，7，8，4′-五甲氧基黃酮，tangeretin）是提取自柑橘屬植物果皮中的一種天然多甲氧基類黃酮類化合物[5]，具有較好的抗氧化活性[6-8]，亦具有抑制破骨細(xì)胞分化和功能的作用[9]，但目前尚未見研究將橘紅素的抗氧化特性與Op聯(lián)系，論證橘紅素對(duì)成骨細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。本研究旨在探究橘紅素預(yù)處理是否具有保護(hù)成骨細(xì)胞免受過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的氧化損傷的作用，擬為從抵御成骨細(xì)胞氧化損傷、保護(hù)成骨細(xì)胞功能角度篩選Op防治藥物提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

橘紅素美國(guó)MCE公司。高糖DMEM、胎牛血清和0.25%胰酶-EDTA美國(guó)Gibco公司；Ⅰ型膠原酶、β-甘油磷酸鈉、L-維生素C、地塞米松，均美國(guó)Sigma公司；H2O2，成都金山公司；CCK-8試劑盒，日本Dojindo公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）染色試劑盒，上海貝博公司；AKP活性檢測(cè)試劑盒，南京建成公司；茜素紅粉末，北京索萊寶公司；ROS檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑盒和BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒，上海碧云天公司；兔抗大鼠成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（osterix，OSX）單克隆抗體、兔抗人骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）多克隆抗體、兔抗大鼠β肌動(dòng)蛋白多克隆抗體（一抗）和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（二抗），均Abcam公司。Galaxy S＋二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)Biotech公司；SW-CT超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Observer5熒光倒置顯微鏡，德國(guó)Zessis公司；BX51熒光正置顯微鏡，日本Olympus公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Labsystems公司；CytoFlEX流式細(xì)胞儀，美國(guó)Beckman Coulter公司；5200凝膠成像儀，上海天能科技有限公司；PowerPac HC凝膠電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 動(dòng)物和成骨細(xì)胞培養(yǎng)

SPF級(jí)SD乳大鼠（出生≤24 h）購(gòu)自珠海百事通生物科技有限公司（SYXK（粵）2020-0051）。實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)（GDPULAC2021054）。酶消化法分離培養(yǎng)成骨細(xì)胞：脊椎脫臼法處死SD乳大鼠、置于75%乙醇中消毒，在超凈臺(tái)內(nèi)分離顱骨并刮除結(jié)締組織和骨膜，剪碎骨片后加入0.25%胰酶-EDTA溶液37℃消化15 min，棄去消化液，再加入0.15%Ⅰ型膠原酶溶液消化2次，每次37℃孵育1 h；離心5 min（400×g）棄消化液，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)胰酶消化傳代，從P2代細(xì)胞開始使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中加入β-甘油磷酸鈉10 mmol·L-1、地塞米松10 nmol·L-1和維生素C 50 mg·L-1）培養(yǎng)。

1.3 AKP染色和茜素紅染色鑒定成骨細(xì)胞

AKP染色：成骨細(xì)胞以2×107L-1密度接種于24孔培養(yǎng)板，經(jīng)10%胎牛血清條件培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，按AKP染色試劑盒說(shuō)明進(jìn)行AKP染色，在顯微鏡下觀察并拍照。

茜素紅染色：成骨細(xì)胞以2×107L-1密度接種于24孔培養(yǎng)板，經(jīng)10%胎牛血清條件培養(yǎng)基培養(yǎng)21 d后，以茜素紅染液進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 CCK-8法檢測(cè)成骨細(xì)胞存活率

成骨細(xì)胞以2×104L-1密度每孔100 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分為細(xì)胞對(duì)照組、模型組（H2O2300 μmol·L-1處理1 h）和模型+橘紅素組（橘紅素5，10，15，20，30 和 40 μmol·L-1預(yù)處理 48 h，加H2O2300 μmol·L-1處理 1 h），每組 6復(fù)孔。去除藥液后，10%胎牛血清條件培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，加入CCK-8 100 μL 37℃孵育2 h后，設(shè)空白溶液（10%胎牛血清條件培養(yǎng)基100 μL+CCK-8溶液10 μL）對(duì)照，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（A450nm）并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（藥物組A450nm-空白對(duì)照組A450nm）（/細(xì)胞對(duì)照組A450nm-空白對(duì)照組A450nm）×100%。

1.5 AKP測(cè)定試劑盒檢測(cè)AKP活性

成骨細(xì)胞按1.4方法接種、分組處理后，再經(jīng)10% FBS條件培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，吸取適量上清液，按堿性磷酸酶（AKP）試劑盒說(shuō)明書操作，設(shè)空白溶液（緩沖液+基質(zhì)液）對(duì)照，在酶標(biāo)儀520 nm波長(zhǎng)處測(cè)A520nm值。AKP活性（U·L-1）=（藥物組A450nm-空白對(duì)照組A450nm）/（標(biāo)準(zhǔn)品A450nm-空白對(duì)照組A450nm）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.1 g·L-1）×1000。

1.6 茜素紅染色檢測(cè)成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量

成骨細(xì)胞以2×107L-1密度每孔100 μL接種于24孔培養(yǎng)板，細(xì)胞分正常對(duì)照組、模型組（以H2O2300 μmol·L-1處理1 h）和模型+橘紅素組（橘紅素10 μmol·L-1預(yù)處理 48 h，H2O2300 μmol·L-1處理1 h），每組3復(fù)孔，細(xì)胞再經(jīng)10%胎牛血清條件培養(yǎng)基培養(yǎng)21 d后，按1.3方法進(jìn)行茜素紅染色，并以BIOQUANT OSTEO分析軟件計(jì)數(shù)各組細(xì)胞20倍鏡下3個(gè)視野的鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量。

1.7 ROS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)成骨細(xì)胞ROS水平

成骨細(xì)胞以1×108L-1密度每孔800 μL接種于6 cm×6 cm培養(yǎng)皿中，按1.6分組處理細(xì)胞，細(xì)胞再經(jīng)10%胎牛血清條件培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，按ROS檢測(cè)試劑盒步驟要求裝載探針，PBS洗凈細(xì)胞后消化收集。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的DCFH-DA熒光，以熒光強(qiáng)度表示ROS水平。

1.8 WST-8法檢測(cè)成骨細(xì)胞SOD活性

成骨細(xì)胞按1.7接種、按1.6分組處理后，再經(jīng)10%胎牛血清條件培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，PBS洗凈細(xì)胞后加入SOD樣品制備液，按SOD活性檢測(cè)試劑盒步驟，設(shè)置空白溶液1（SOD檢測(cè)緩沖液20 μL+WST-8/酶工作液 160 μL+反應(yīng)啟動(dòng)工作液 20 μL）和空白溶液 2（SOD 檢測(cè)緩沖液 40 μL+WST-8/酶工作液160 μL），在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)A450nm。按照試劑盒方法計(jì)算SOD活性。抑制百分率（%）=（空白對(duì)照1A450nm-藥物組A450nm）/（空白對(duì)照1A450nm-空白對(duì)照2A450nm）×100%。SOD活性（U·g-1蛋白）=抑制百分率/（1-抑制百分率）/樣品蛋白含量（g）。

1.9 Western印跡法測(cè)定成骨細(xì)胞OSX和OPG蛋白表達(dá)

成骨細(xì)胞以5×108L-1密度接種于10 cm×10 cm培養(yǎng)皿中，分組處理同1.6。再經(jīng)10%胎牛血清條件培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，RIPA蛋白抽提試劑提取總蛋白，按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒方法測(cè)定各組蛋白質(zhì)濃度。各組取等量蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜1 h，經(jīng)TBST洗膜5 min×3次后用含5%脫脂奶粉的TBST溶液搖床輕搖封閉2 h，再用TBST洗膜5 min×3次后加入一抗（1∶2000），β肌動(dòng)蛋白（1∶5000）4℃搖床孵育過(guò)夜，次日室溫孵育1 h，TBST洗膜5 min×3次后加二抗（1∶1000），4℃搖床孵育1 h，TBST 洗膜5 min×3次，經(jīng)曝光、顯影、定影后獲得蛋白膠片，凝膠成像系統(tǒng)拍照后以Image J軟件測(cè)定目標(biāo)蛋白積分吸光度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度值比值表示待測(cè)蛋白表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad prism 8軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞鑒定

原代成骨細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后，細(xì)胞呈飽滿多角形、長(zhǎng)梭形（圖1A），連續(xù)培養(yǎng)7 d后細(xì)胞經(jīng)AKP染色細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)色（圖1B）；連續(xù)培養(yǎng)21 d后可見成骨基質(zhì)鈣化產(chǎn)物堆集成灶、形成大小不一的類圓形結(jié)節(jié)，經(jīng)茜素紅染色結(jié)節(jié)呈深紅色（圖1C）。

Fig.1 ldentification of osteoblasts.A：osteoblasts isolated from rat calvaria by enzyme digestion；B：alkaline phosphatase（AKP）staining results of osteoblasts；C：alizalin red staining results of osteoblasts.

2.2 橘紅素預(yù)處理對(duì)H2O2損傷的成骨細(xì)胞存活率的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表1），與細(xì)胞對(duì)照組相比，模型組成骨細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，模型+橘紅素10，15，20和30 μmol·L-1預(yù)處理組細(xì)胞存活率明顯提高（P＜0.01）。

Tab.1 Effect of tangeretin pretreatment on cell viability of osteoblasts injured by H2O2

2.3 橘紅素預(yù)處理對(duì)H2O2損傷的成骨細(xì)胞AKP活性的影響

AKP活性測(cè)定結(jié)果（表2）表明，與細(xì)胞對(duì)照組相比，模型組成骨細(xì)胞AKP活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，模型+橘紅素10，15和20 μmol·L-1預(yù)處理組細(xì)胞AKP活性明顯增加（P＜0.05）。綜合上述結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇橘紅素預(yù)處理給藥濃度為10 μmol·L-1。

Tab.2 Effect of tangeretin pretreatment on alkaline phosphatase（AKP）activity of osteoblasts injured by H2O2

2.4 橘紅素預(yù)處理對(duì)H2O2損傷的成骨細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)數(shù)量的影響

茜素紅染色結(jié)果如圖2和表3所示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少（P＜0.05）；與模型組相比，模型+橘紅素10 μmol·L-1預(yù)處理組鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增加（P＜0.05）。

Fig.2 Effect of tangeretin pretreatment on numbers of mineralized nodules of osteoblasts injured by H2O2（alizalin red staining）.Osteoblasts were pretreated with tangeretin 10 μmol· L-1for 48 h，and then exposed to H2O2 300 μmol· L-1for 1 h.Then，H2O2was replaced with regular medium and cells were placed back into an incubator at 37℃and 5% CO2for 21 d.Calcified nodules ware indicated by arrows.

Tab.3 Effect of tangeretin pretreatment on numbers of mineralized nodules of osteoblasts injured by H2O2

2.5 橘紅素預(yù)處理對(duì)H2O2損傷的成骨細(xì)胞ROS水平的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示（表4），與細(xì)胞對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞ROS水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+橘紅素10 μmol·L-1預(yù)處理組細(xì)胞ROS水平明顯降低（P＜0.01）。

Tab.4 Effect of tangeretin pretreatment on intercellular ROS level of osteoblasts injured by H2O2

2.6 橘紅素預(yù)處理對(duì)H2O2損傷的成骨細(xì)胞SOD活性的影響

WST-8法檢測(cè)成骨細(xì)胞中SOD活性結(jié)果（表5）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，模型組SOD活性顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，模型+橘紅素10 μmol·L-1預(yù)處理組SOD活性顯著升高（P＜0.01）。

Tab.5 Effect of tangeretin pretreatment on activity of superoxide dismutase（SOD）of osteoblasts injured by H2O2

2.7 橘紅素預(yù)處理對(duì)H2O2損傷的成骨細(xì)胞OSX和OPG蛋白表達(dá)水平的影響

Western印跡結(jié)果（圖3）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞OSX和OPG的蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，模型+橘紅素10 μmol·L-1預(yù)處理組細(xì)胞OPG和OSX的蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of tangeretin on protein expressions of osterix（OSX） and osteoprotegerin（OPG） of osteoblasts injured by H2O2by Western blotting.See Tab.4 for the cell treatment.B was the semiquantitative result of A.IA：integrated absorbance.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with model group.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，橘紅素預(yù)處理不僅能提高氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷的成骨細(xì)胞的存活率和成骨細(xì)胞AKP活性，亦能使成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量增加，說(shuō)明橘紅素可改善氧化應(yīng)激狀態(tài)下成骨細(xì)胞的分化和礦化能力、恢復(fù)了成骨功能。此外，橘紅素預(yù)處理能明顯提高氧化應(yīng)激狀態(tài)下成骨細(xì)胞OSX和OPG表達(dá)。OSX是成骨細(xì)胞分化和礦化中的重要轉(zhuǎn)錄因子，能誘導(dǎo)一系列成骨功能關(guān)鍵蛋白（如骨鈣素等）的表達(dá)[10-12]，且能顯著提高成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶水平[13]，這與本研究中橘紅素預(yù)處理能增加成骨細(xì)胞分泌的AKP活性的結(jié)果一致。OPG是維持骨代謝穩(wěn)態(tài)的重要因子，其表達(dá)增加可抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能，有利于維持骨量[14]；橘紅素可能通過(guò)提高OPG的表達(dá)抑制破骨細(xì)胞功能，這與文獻(xiàn)報(bào)道中橘紅素對(duì)破骨細(xì)胞的影響結(jié)論一致[9，15]。

氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷是Op等增齡性疾病的共同致病因子[16]。隨著機(jī)體衰老，細(xì)胞抗氧化防御功能下降，氧化應(yīng)激增加并引起細(xì)胞膜、細(xì)胞漿及線粒體DNA的破壞，抑制成骨細(xì)胞增殖分化，導(dǎo)致骨代謝異常，出現(xiàn)骨量下降和骨質(zhì)破壞[17-18]。本研究結(jié)果顯示，橘紅素預(yù)處理可有效減少H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS累積，并使成骨細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下具有更高的SOD水平，說(shuō)明橘紅素能保護(hù)成骨細(xì)胞抵御H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷。

綜上所述，橘紅素預(yù)處理能夠提高氧化損傷的成骨細(xì)胞的存活率和成骨礦化能力，此抗氧化保護(hù)作用與橘紅素激活成骨細(xì)胞SOD活性、減少ROS累積、減輕氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷有關(guān)，但其具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。橘紅素具有防治Op的潛力，在相關(guān)藥物和功能食品開發(fā)中具有一定的應(yīng)用前景。