應用同位素標記相對和絕對定量蛋白質組學方法篩選漿細胞性乳腺炎病人差異表達蛋白質

陳波 趙侃侃 盧文亮 鄭媛

漿細胞性乳腺炎(plasma cell mastitis,PCM)又稱導管周圍炎或導管擴張癥，常發生于非哺乳期婦女,其發病機制目前仍未完全明確[1-2],其臨床表現復雜多樣，易反復，臨床誤診率較高，治療難度較大，國內外尚無統一的診療指南。探索PCM的發病機制和病理生理過程對治療具有重要意義。同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)是近年來定量蛋白質組學常用的高通量篩選技術，標記效率高、標記過程簡單、靈敏度高、適用范圍廣[3]。本研究應用iTRAQ定量蛋白質組學方法，探索PCM組織的蛋白譜，并通過生物信息學分析，篩選差異蛋白、進行功能富集分析，研究差異蛋白可能的功能，初步鑒定出在PCM發生、發展中的關鍵分子。報道如下。

對象與方法

一、對象

PCM病人病灶組織(4例)和對應的鄰近正常組織(對照組)均來自湖北省婦幼保健院甲乳外科進行手術治療的病人。均經過病理檢查證實為PCM。

二、方法

1.蛋白提取：對4例PCM病人的病灶組織及病灶旁正常組織樣本用遇冷的PBS清洗，冰浴超聲5分鐘，離心后取上清，加等體積的100%乙腈溶液，混合均勻，冰上放置1小時;沉淀完成后離心，取上清液，冷凍收干至體積縮小一半后，用預先潤濕的10 KD超濾管10 000 g，4 ℃離心，再用200 μl超純水重復上述操作。收集穿透液，加入1%的甲酸調pH至2～3。取2 μl蛋白樣品，稀釋到合適倍數，用Bradford法測定蛋白濃度。

2.iTRAQ標記和分級分離：取酶解除鹽后的肽段，根據iTRAQ-8標試劑盒(SCIEX)說明書進行標記，樣本標記后混合，然后將混合后的肽段運用Ultimate 3000 HPLC系統(Thermo DINOEX,USA)對肽段樣品進行分級分離。

3.LC-MS/MS分析：分離后的肽段樣品，使用與EKsigent nanoLC系統(AB SCIEX,USA)偶聯的Triple TOF 5600 plus質譜儀進行分析。本研究使用的是武漢金瑞開有限公司蛋白質組學技術平臺。質譜下機數據利用Protein Pilot 4.5軟件進行數據庫檢索分析。

4.生物信息學分析：對蛋白質鑒定的基本流程為選出可信蛋白，根據分析模式組合數據，選出可分析蛋白，選出差異蛋白。本研究中，PCM差異蛋白標準為：adj.P-value≤ 0.05情況下，差異倍數≥2.0(表達上調)或差異倍數≤0.50(表達下調)。差異蛋白的功能富集分析采用GO和KEGG進行注釋。基因本體論(Gene Ontology,GO)是一個國際標準化的基因功能分類體系，包括分子功能(molecular function)，細胞組分(cellular component)，生物學過程(biological process)。京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)是有關通路的主要公共數據庫。通過KEGG分析，能確定蛋白質參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。

結果

1.iTRAQ蛋白質組學技術篩選的PCM中差異表達的蛋白：應用iTRAQ蛋白質組學技術對PCM組織和正常組織進行蛋白組學分析，見圖1。根據預先設置的差異蛋白的標準，在PCM中，915個蛋白表達量發生顯著變化(上調795個蛋白，下調120個蛋白)。差異最顯著的10種蛋白，以及這些蛋白的功能見表1。

表1 PCM與對照組織排名前10的差異表達蛋白及功能富集分析

圖1 PCM與對照組織差異表達蛋白火山圖

2.差異蛋白功能富集分析結果：在PCM中差異表達的蛋白質主要功能見圖2。這些差異表達的蛋白質主要參與的生物學過程包括細胞細胞黏附、糖酵解、翻譯起始、調控炎癥反應、對真菌的防疫反應、細胞氧化還原穩態等過程。這些差異蛋白主要參與形成的細胞學組分包括細胞外泌體，細胞外基質、細胞質、細胞膜、線粒體等。這些差異蛋白質的主要功能包括結合RNA，介導細胞細胞黏附、結合蛋白激酶、結合MHC Ⅱ類蛋白復合物等。

圖2 差異蛋白GO富集分析

3.差異蛋白KEGG通路富集結果：在PCM中差異表達的蛋白質主要參與的信號通路見圖3。其中，代謝通路中，差異蛋白主要參與碳水化合物代謝通路、脂質代謝通路、能量代謝通路等。此外，差異蛋白還參與信號轉導、細胞增殖和死亡、免疫系統、內分泌系統、感染性疾病、腫瘤、免疫性疾病等信號通路。

圖3 差異蛋白KEGG分析

討論

PCM的病因未明，病程較長，臨床表現復雜多樣，極易錯過最佳治療時機，部分病人最后不得不行乳房切除[4]。給病人身心健康造成造成嚴重影響。因此，從蛋白質組學層面探索影響PCM病理生理的關鍵分子具有重要意義。本研究通過iTRAQ定量蛋白質組學方法篩選到915個差異表達蛋白，并通過生物信息學的方法分析了這些差異蛋白可能的功能和信號通路。

有研究表明，PCM與自身免疫系統功能紊亂有關[5-10]。PCM的病理基礎是由多種原因引起的乳腺導管擴張，導管上皮細胞破壞、脫落，角化的碎屑和脂質分泌物堵塞管腔，從而刺激乳腺導管壁周圍產生炎癥反應，漿細胞、中性粒細胞、淋巴細胞及泡沫細胞等慢性炎性細胞浸潤[8]。我們的研究支持上述研究結論。在PCM中，KEGG通路分析表明我們篩選到的差異蛋白主要參與免疫系統相關通路。蛋白結構域分析也表明這些差異蛋白主要富集在免疫球蛋白結構域。因此，免疫系統功能與PCM的發生、發展值得進一步的研究。此外，我們的研究發現這些差異蛋白參與感染性疾病(細菌，病毒和寄生蟲)相關通路。關于PCM與感染的關系，存在很大爭議。有研究在PCM病人組織中培養出多種類型的細菌、真菌以及分枝桿菌[11-13]。也有研究表明，PCM組織中細菌檢出率和正常對照組織無明顯差異[14]。本研究結果表明，在PCM組織中差異表達的蛋白質顯著富集在感染性疾病相關通路。說明感染在PCM的發生發展中起一定的作用。

本研究樣本量偏小是其局限性。通過蛋白質組學技術分析PCM蛋白表達譜，篩選出了一些關鍵作用的分子，為后續縮小研究范圍提供了參考。