基于SIRT1觀察補精益視片對自發性青光眼模型DBA/2J小鼠RGCs凋亡的干預及影響

楊鳳姣 李翔 劉紅佶 萬婧雯 易文華

青光眼是以持續性RGCs丟失、視神經軸突變性及特征性視野缺損縮小為特征的一組致盲性視神經病變，是世界第一位不可逆性致盲眼病，發病率和致盲率不斷上升。預計2040年將達1億1180萬[1]。目前針對青光眼的治療主要是降眼壓藥物和保護視神經，降低眼壓仍然是治療青光眼的最有效手段。但單純控制眼壓并不能完全阻止RGCs的凋亡，這表明除病理性眼壓升高的主要危險因素外，還存在其他損害機制[2]。我們前期實驗及臨床研究均證實補精益視片可保護青光眼視功能[3-10]，但對RGCs保護作用機制研究不夠深入，治療靶點欠明確。沉默信息調節因子相關酶1(sirtuintypel，SIRT1)是一種細胞代謝輔酶NAD依賴的Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，是Sirtuin家族中被研究最深入的一員，SIRT1在眼部角膜、虹膜、葡萄膜、睫狀體、晶狀體、視網膜等組織中均有表達[11-14]，在葡萄膜炎、白內障、視神經病變以及視網膜退行性疾病發揮作用，尤其對視網膜及視神經退行性變化有保護作用[15-16]，近年發現促進SIRT1活性對青光眼RGCs凋亡有一定保護作用，促進SIRT1活性可能成為青光眼新型藥物治療靶點[17-20]，但尚無中藥干預的研究。故本課題通過觀察補精益視片對自發性青光眼模型DBA/2J小鼠RGCs的SIRT1活性及RGCs凋亡的干預及影響,為進一步尋找補精益視片保護青光眼視功能的治療靶點提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1模型動物、實驗分組與治療藥物 模型動物購置：DBA/2J青光眼模型基因小鼠、對照組C57BL/6J小鼠，均購于上海斯萊克有限責任公司，動物批號：19082808451783CF。該試驗已通過實驗動物倫理委員會審核，倫理批件G2020001。實驗分組：對照組6只(C57BL/6J小鼠)、模型組6只(DBA/2J小鼠)、給藥組每組各6只(DBA/2J小鼠補精益視片高、中、低劑量組)。治療藥物：補精益視片為成都中醫藥大學附屬醫院院內制劑，規格：100片/瓶，每片重0.3g，川藥制字Z20070649。

1.2主要試劑及儀器 Neurobasal/B27培養基購自Life公司，CCK8細胞增殖檢測試劑盒購自Solarbio公司，Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自日本同仁公司，中強度RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒及ECL發光液均購自弗德生物公司，SDS購自Acmec公司，SIRT1抗體購自Abcam公司，細胞培養箱、臺式高速離心機均購自Thermo Fisher公司，生物倒置顯微鏡購自Nikon公司，脫色搖床購自其林貝爾儀器公司，電泳儀購自Bioneer公司，流式細胞儀購自BD公司，熒光定量PCR儀購自ABI公司，酶標儀購自東華電子公司。

1.3給藥方法 對照組、模型組生理鹽水2mL灌胃，給藥組各組每天灌胃補精益視片混懸液2mL，低劑量組0.45g/kg、中劑量組0.9g/kg、高劑量組1.8g/kg，每天同一時間段(2:00pm～5:00pm)測眼壓后灌胃1次，連續灌胃8周。

1.4取樣 藥物處理小鼠8周后取眼球：5組，每組6只小鼠，各組小鼠分別在喂養8周后摘除眼球并固定，處死動物，取眼球樣本(左眼和右眼)，共計60個樣本，并妥善保存。其中30個眼球組織樣本(左眼)用多聚甲醛固定，用于HE染色病理實驗；另外30個眼球樣本(右眼)，制備視網膜神經節細胞懸液，-80℃保存，用于Q-PCR、Western Blot、流式細胞術、CCK-8實驗。

1.5檢測指標及技術

1.5.1Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術檢測各組RGCs凋亡率 ①用PBS洗滌孔內細胞三次，加入不含EDTA的胰酶消化收集細胞；②室溫，2000 rpm離心5min，收集細胞，用PBS洗滌細胞兩次；③在50μL的Binding Buffer中加入5μL PI染液，混勻；④在收集的細胞沉淀中加入上述PI染液，混勻，室溫避光反應15min；⑤反應后加入450μL的Binding Buffer混勻；⑥加入1μL Annexin V-FITC混勻，室溫避光反應15 min；⑦用流式細胞儀檢測，激發波長Ex=488 nm，發射波長Em=530 nm，Annexin V-FITC熒光信號呈綠色，使用FL1通道檢測，激發波長Ex=488nm，發射波長Em≥630 nm，PI紅色熒光用FL3通道檢測于48h時間點收集各組細胞，上流式細胞儀進行檢測，得到四個象限內細胞百分比，計算右上和右下象限內細胞百分比和，每組重復3次，最后取平均值，得出細胞凋亡率。

1.5.2CCK-8檢測各組RGCs存活 提取的各組小鼠視網膜神經節細胞懸液，以5×104/mL的細胞密度接種于96孔板內，每孔加入液體100μL，37℃孵箱培養24 h后，以含3%胎牛血清培養基培養24h，每孔加10μL CCK-8試劑，酶標儀測光度值、吸光度值計算各組細胞間的存活率。

1.5.3Q-PCR檢測各組RGCs的SIRT1 mRNA表達 先提取總RNA，然后逆轉錄反應：取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液，加入1μL oligo(dT)15，用無核糖核酸酶的去離子水補足至12μL，于PCR儀上70℃保溫5min，迅速置冰上冷卻，依次加入4μL 5×buffer，2μL 10mM dNTPs，1μL RNA inhibitor和1μL 反轉錄酶，用槍抽吸混勻，于PCR儀上42℃保溫30min，結束后80℃保溫5min滅活反轉錄酶，其次定量PCR反應，循環結束后從55℃升高到95℃獲取熔解曲線，進行結果分析：ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待測樣本)-CT(內標基因，待測樣本)，B=CT(目的基因，對照樣本)-CT(內標基因，對照樣本)，K=A-B，表達倍數=2-K。

1.5.4Western Blot檢測各組RGCs的SIRT1蛋白表達 提取蛋白并測量蛋白濃度，進行樣品蛋白處理：將待測樣本分別與5×SDS上樣緩沖液按4∶1比例混合，置于沸水中加熱5min，立即置于冰上3min；上樣，電泳：將玻璃板對齊后放入夾中卡緊，按實驗安排配制分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠，約45min后可倒去膠上層水并用吸水紙將剩余水吸干， 配制5%的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠，將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中，加足夠的電泳液后上樣電泳，濃縮膠電壓75V，分離膠用120V，電泳至溴酚藍剛跑出即可終止電泳，進行轉PVDF膜，轉膜條件：200mA，1小時；封閉，顯影；進行圖像分析：以β-actin作為內參，以目的條帶與內參條帶的比值代表各組目的蛋白的表達水平，每個目的條帶Western blot重復3次。

2 統計方法

3 結果

3.1眼壓 實驗前、后模型組與對照組相比均高(P<0.05)，模型組實驗后與實驗前相比差異無統計學意義。高、中、低劑量給藥組實驗后與實驗前相比均明顯降低(P<0.01)，與模型組比較降低(P<0.05)，說明補精益視片有降低眼壓的作用(表1)。

表1 各組小鼠實驗前后眼壓情況每組n=6)

3.2補精益視片對體外培養小鼠RGCs中的SIRT1mRNA表達的影響 結果表明：模型組與對照組相比降低(P<0.05)，高、中、低劑量給藥組與模型組相比均升高(P<0.05)、高劑量組最高，說明模型組RGCs SIRT1 mRNA表達明顯降低，補精益視片能提高RGCs的SIRT1 mRNA表達量，且與劑量呈正相關(圖1-2、表2)。

表2 各組體外培養小鼠RGCs的SIRT1 mRNA表達情況每組n=6)

圖1 SIRT1實時熒光定量PCR(A:Melt Curve B:Amplification Plot)

3.3補精益視片對體外培養小鼠RGCs中的SIRT1蛋白表達的影響 Weston blot蛋白印跡法結果顯示：模型組RGCs的 SIRT1蛋白表達與對照組相比降低(P<0.05)，高、中、低劑量給藥組與模型組相比均升高(P<0.05)，高劑量組最高(P<0.05)，說明模型組RGCs的SIRT1蛋白表達明顯降低，補精益視片能提高RGCs的SIRT1 mRNA表達量，且與劑量呈正相關(圖3-4、表3)。

表3 各組體外培養小鼠RGCs中的SIRT1蛋白表達每組n=6)

圖3 各組體外培養小鼠RGCs中的SIRT1蛋白表達

3.4補精益視片對體外培養小鼠RGCs凋亡的影響 AnnexinV/PI流式細胞術檢測結果表明：模型組凋亡率較對照組明顯升高(P<0.05)，高、中、低劑量給藥組凋亡率均低于模型組(P<0.05)，高劑量組最低，表明補精益視片對細胞凋亡起到了抑制作用，且與劑量呈正相關(表4、圖5)。

圖5 補精益視片對體外培養小鼠RGCs凋亡的影響

表4 補精益視片對體外培養小鼠RGCs凋亡率的影響每組n=6)

3.5補精益視片對體外培養小鼠RGCs存活的影響 CCK-8法檢測各組RGCs存活結果表明：RGCs經24h、48h、72h培養后細胞RGCs生存率(OD值)，模型組與對照組相比均降低(P<0.05)，高、中、低劑量給藥組均高于模型組(P<0.05)，高劑量組最高，表明模型組RGCs存活率明顯降低，而補精益視片對RGCs存活有促進作用，且與劑量呈正相關(表5，圖6)。

圖6 各組體外培養小鼠RGCs細胞增殖情況

表5 各組體外培養小鼠RGCs細胞增殖情況每組n=6)

*P<0.05 vs 對照組，#P<0.05 vs 模型組

圖2 各組體外培養小鼠RGCs的SIRT1 mRNA表達情況

圖4 各組體外培養小鼠RGCs中的SIRT1蛋白表達

4 討論

自發性青光眼小鼠DBA/2J模型能更好地模擬臨床青光眼發病特點，也更適于表觀遺傳學機制研究，2～3月齡DBA/2J小鼠虹膜眼壓視網膜和視神經的組織結構均正常，6月齡開始出現眼壓升高和明顯的虹膜異常，8～9月齡開始出現RGCs和視神經的變性到18個月，且雌性發病早，進展快，眼壓更高，視神經損害較重，故本研究選擇10月齡雌性DBA/2J小鼠為研究對象[21-23]，而C57BL/6J小鼠被廣泛用于DBA/2J小鼠正常對照實驗，故以C57BL/6J小鼠為對照組[24-25]。

組蛋白乙酰化修飾作為表觀遺傳學重要機制之一，在細胞分化和凋亡中發揮重要作用，已廣泛應用于心血管疾病、腫瘤及退行性神經系統疾病等疾病的研究[26-28]，其中SIRT1是調控衰老、神經功能、細胞凋亡的關鍵因子[29]。研究證實SIRT1表達活性的下調可能是青光眼發病因素之一、SIRT1與青光眼小梁網細胞 (GTM)DNA雙鏈損傷修復能力與細胞衰老有關[30]，有學者對RGC-5研究發現SIRT1上調能減弱RGC-5凋亡[31]，通過研究大鼠視神經損傷模型也發現SIRT1參與視神經損傷及修復過程[32]，促進SIRT1活性可能成為青光眼新型藥物治療靶點[33]。補精益視片(枸杞子、菟絲子、五味子、丹參、三七、茺蔚子、楮實子、車前子、青皮、木瓜)為中醫眼科名家陳達夫教授經驗制成的成都中醫院大學附屬醫院院內制劑，廣泛用于肝腎虛損、脈絡瘀滯所致的眼目昏花、視神經視網膜功能減退等癥，備受醫患青睞[34]，其滋養肝腎、活血通絡的功效，切合青光眼視神經病變“肝腎虛損、脈絡瘀滯”的主要病機[35]，我們前期實驗發現補精益視片對SD大鼠青光眼視功能損害從RGCs、視神經至視中樞均具有確切保護作用[4-10]。臨床也證實補精益視片治療眼壓控制后青光眼療效確切，可不同程度改善患者中醫癥狀，提高視力、視覺敏感度，有效控制視野缺損，從而保護青光眼患者視功能[3-4]。

本研究基于SIRT1觀察補精益視片對自發性青光眼模型DBA/2J小鼠RGCs凋亡的干預及影響，眼壓結果提示高、中、低劑量給藥組實驗后與實驗前相比、與模型組相比，眼壓值均明顯降低，說明補精益視片能降低眼壓；通過Q-PCR檢測SIRT1 mRNA表達發現模型組RGCs中的SIRT1 mRNA表達低于對照組；高、中、低劑量給藥組SIRT1 mRNA表達均升高，尤以高劑量組表達最高，說明補精益視片能增加小鼠RGCs的SIRT1 mRNA表達；通過Western Blot檢測RGCs的SIRT1蛋白表達量發現模型組低于對照組，高、中、低劑量給藥組均高于模型組，高劑量組表達量最多，說明補精益視片能促進小鼠RGCs的SIRT1蛋白表達，以上表明補精益視片上調SIRT1的表達作用可能類于SIRT1“激動劑”；另外，Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術檢測各組RGCs凋亡率發現，模型組高于對照組，高、中、低劑量給藥組均低于模型組，高劑量組最低，CCK-8檢測各組RGCs生存結果表明：模型組低于對照組，高、中、低劑量給藥組均高于模型組，高劑量組最高，進一步證實了補精益視片抑制小鼠RGCs凋亡，促進小鼠RGCs細胞存活作用。

綜上所述，補精益視片既可上調SIRT1組蛋白去乙酰化酶，促進RGCs存活、抑制RGCs調亡、增加RGCs的SIRT1 mRNA及蛋白表達，且均與劑量呈正相關，又能降眼壓，表明補精益視片可通過降低眼壓、上調SIRT1組蛋白去乙酰化酶、抑制RGCs凋亡、促進RGCs生存而實現保護青光眼視功能的作用，推測其治療靶點可能為促進SIRT1活性，為將補精益視片開發成青光眼視功能損害保護新藥奠定科學基礎，惠及更多青光眼患者。