長白落葉松種子園遺傳多樣性分析
2022-06-15 17:32:25邱新宇張磊張含國閆平玉
森林工程 2022年3期
邱新宇 張磊 張含國 閆平玉
摘 要：為分析長白落葉松生產群體的遺傳多樣性及其變化趨勢，為落葉松優良種質資源收集、保護和多世代遺傳改良提供科學依據。該文從270對松科SSR（Simple Sequence Repeat）通用引物中篩選出多態性高的30對引物，利用SSR分子標記對林口縣青山林場長白落葉松種子園105個單株進行遺傳分析。結果表明，30對引物共檢測到258對等位基因，群體平均觀測等位基因數（Average number of observed alleles，Na）為2.833，平均有效等位基因數（Average number of effective alleles，Ne）為1.814，平均觀測雜合度（Average observed heterozygosity，Ho）為0.404，平均期望雜合度（Average expected heterozygosity，He）為0.401;群體內近交系數（Inbreeding coefficient in population，Fis）、群體總近交系數（Total inbreeding coefficient in population，Fit）均為負值，表現出群體輕微雜合子過量，未出現近交衰退現象;Shannon多樣性指數（I）為0.694，多態性信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）為0.354 1，具有較高遺傳多樣性，遺傳變異主要源于群體內;UPGMA聚類圖以0.692為閾值，可以將105個單株分為4個類群。該研究篩選出的SSR引物具有較好通用性，長白落葉松種子園遺傳多樣性較高，無性系群體遺傳變異水平沒有降低。
關鍵詞：長白落葉松;SSR標記;通用性;遺傳多樣性;聚類分析
中圖分類號：S791.22??? 文獻標識碼：A?? 文章編號：1006-8023（2022）03-0016-10
Genetic Diversity Analysis of Larix olgensis Clone Seed Orchards
QIU Xinyu， ZHANG Lei， ZHANG Hanguo*， YAN Pingyu
（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）
Abstract：In order to understand the genetic diversity and change trend of Larix olgensis production groups， and to provide scientific basis for collection， protection and multi-generation genetic improvement of L. olgensis excellent breeding resource， 30 pairs of primers with high polymorphism were selected from 270 pairs of Pinaceae SSR universal primers， and 105 individual plants of L. olgensis seed orchard in Linkou Qingshan forest farm were analyzed by SSR molecular markers. The results showed that a total of 258 pairs of alleles were detected with 30 pairs of primers， the average number of observed alleles （Na） was 2.833， the average number of effective alleles （Ne） was 1.814， the average observed heterozygosity （Ho） was 0.404， and the average expected heterozygosity （He） was 0.401. The inbreeding coefficient in population （Fis） and total inbreeding coefficient in population （Fit） were negative， indicated a slight heterozygote excess and no inbreeding decline. The Shannon diversity index （I） was 0.694， and the polymorphism information content （PIC） was 0.354 1， exhibited a high genetic diversity and genetic variation was mainly within the population. The UPGMA cluster diagram took 0.692 as the threshold and divided the 105 individual plants into four groups. The SSR primers for this study have good versatility， the genetic diversity of L. olgensis seed orchard is high， and the genetic variation level of clonal population is not reduced.D122F754-E377-415C-80AE-3A2ED7EE363C
Keywords：Larix olgensis; SSR; transferability; genetic diversity;clustering analysis
0 引言
長白落葉松（Larix olgensis）為松科（Pinaceae）落葉松屬（Larix）落葉喬木，是我國優良的速生用材、紙漿材樹種，也是東北地區森林更新和荒山造林的主要樹種之一[1]，且因其樹干通直、圓滿，木材耐腐、 耐濕，具有生長迅速、適應性強和分布廣等特點，是電業、煤礦、造船、橋梁和鐵路等方面的優良用材[2]，保存并延續其優良性狀一直是科研人員的研究重點。建立種子園是有效提高樹木種實遺傳品質的根本途徑之一。種子園指由優樹無性系或家系建立起來的，以生產優質種實為目的的林地。優樹是從條件相似、林齡相同或相近的同種天然林或人工林中選拔出來的表型優良樹木個體，優樹無性系指優樹嫁接苗、扦插苗和組織培養苗等繁殖材料，優樹家系指由優樹自由授粉或控制授粉后所形成的繁殖材料。種子園既要獲得較高的遺傳增益，又必須保持較寬的遺傳基礎[3]，但是作為種子園親本群體的優樹基因庫是有限的，加之還需在一定條件下選育，很大比例的天然群體將被淘汰，從而造成其遺傳基礎過窄，多樣性流失，在育種群體和生產群體中往往出現近交和共祖現象，近交使其適應力降低，隨著遺傳改良力度加大，遺傳基礎會越來越窄，阻礙遺傳改良活動長久開展[4]。當前，種子園遺傳基礎過窄是林木多世代改良中最值得關注的問題，在分子水平上對其遺傳多樣性水平和群體結構進行科學分析和評價十分必要。
隨著生物技術不斷發展，分子標記成為生物信息學最重要的研究手段之一，利用分子標記技術可以實現物種各群體遺傳學參數和親緣關系的快速分析[5]。簡單重復序列（Simple Sequence Repeat，SSR）是以PCR技術為核心的DNA分子標記技術，或稱微衛星序列標記（Microsatellite Sequence，MS），在落葉松屬植物遺傳分析和基因型分析中得到廣泛應用[6]。何清偉[7]利用20對SSR分子標記選出的華北落葉松（Larix principis-rupprechtii）和長白落葉松優樹群體擁有相對較寬的遺傳參數變化范圍;董明亮[8]利用新開發的SSR標記得出華北落葉松種子園的遺傳多樣性處于中等水平;貫春雨等[9]利用RAPD、SSR分子標記得到日本落葉松（Larix kaempferi）×興安落葉松（Larix gmelinii）雜種F1代群體遺傳多樣性水平各指數基本一致的結論;于大德[10]利用10對SSR引物揭示出華北落葉松種子園親子代之間遺傳多樣性沒有顯著變化，并認為在后續育種工作中可繼續進行高世代優樹選擇，不必過度擔心遺傳多樣性降低。上述研究結果為落葉松遺傳改良提供了理論依據，并為落葉松資源高效利用奠定了基礎。
相較闊葉樹種而言，基因組較大、DNA序列缺乏的針葉樹種多樣性研究較為滯后，主要是缺乏有效的分子標記，尤其是多態性好、通用性高的共顯性標記。由于微衛星序列側翼有相當保守的DNA序列，使得微衛星引物具有較高的通用性，因此在同一物種間或物種親緣關系較近的物種間，甚至分類地位很近的物種間，可以利用引物序列的通用性進行遺傳學研究[4]。物種間所開發的SSR標記或許可以作為可參考的重要標記來源，并能夠顯著降低SSR標記開發成本，但關于落葉松SSR標記開發的研究比起模式植物和其他物種相對較少。Zhang等[11]利用74條含有興安落葉松SSR的序列設計45對SSR引物，在日本落葉松、華北落葉松和長白落葉松中均成功進行了跨物種擴增;劉超等[12]利用1 788個日本落葉松SSR位點設計500對引物，隨機合成102對，以紅豆杉科（Taxaceae）、柏科（Cupressaceae）、松科材料為模板進行通用性檢測，結果顯示擴增率均在70%以上，并利用101對SSR引物對7種不同落葉松品種親緣關系進行了分析。以上研究表明，不同松科植物間的SSR引物具有良好的通用性。本研究從270對松科SSR通用引物中篩選出多態性高的30對引物，利用SSR分子標記對林口縣青山林場長白落葉松種子園105個單株進行遺傳分析，以期了解長白落葉松生產群體的遺傳多樣性及其變化趨勢，為落葉松優良種質資源收集、保護和多世代遺傳改良提供科學依據。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
試驗材料來源于黑龍江省林口縣青山林場長白落葉松無性系種子園，無性系親本采自小北湖林場天然母樹林，1994年定植，于第78區采取105株無性系單株。樣本采用當年生幼嫩針葉，分袋標記，冰袋運輸至實驗室-80 ℃冷凍保存。
1.2 試驗方法
1.2.1 基因組DNA提取
使用北京天根生化科技有限公司生產的DNA試劑盒提取樣品總DNA，并采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對其進行檢測，如圖1所示，DNA條帶清晰明亮，無拖尾彌散。利用Micro Drop超微量分光光度計測得質量濃度均在100 mg/mL以上，A260/A280為1.8～2.0（核酸純度的指示值，純凈的DNA樣品A260/A280大于1.8，如果比值低于1.8，表示存在蛋白質或酸類物質的影響），DNA質量滿足后續試驗要求。將DNA質量濃度稀釋至相同濃度20 mg/mL備用。
1.2.2 引物篩選
對已發表的松科SSR引物進行篩選，得到火炬松（Pinus taeda）[13-14]、美國白皮松（Pinus albicauli）[15]、大別山五針松（Pinus dabeshanensis）[16]、華山松（Pinus armandii）[17]、紅松（Pinus koraiensis）[18]、馬尾松（Pinus massoniana）[19]、毛枝五針松（Pinus wangii）[20]、日本落葉松[12，21-22]、華北落葉松[6]和興安落葉松[23-24] 10個物種共計270對SSR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，隨機選取5個樣本DNA對合成引物進行初步篩選，并用3%瓊脂糖凝膠進行目的條帶檢測，二次篩選用40個樣本DNA對可擴增出目的條帶的引物進行多態性篩選，并用8%聚丙烯酰胺凝膠進行目的條帶檢測，進一步篩選獲得30對多態性高、重復性好的引物用于遺傳多樣性分析。D122F754-E377-415C-80AE-3A2ED7EE363C
1.2.3 SSR-PCR反應體系和擴增程序
以長白落葉松基因組DNA為模板，SSR-PCR反應體系和擴增程序參照姚宇的研究方法[4]進行優化。反應體系和擴增條件見表1和表2。
1.2.4 PCR產物電泳檢測
基于SSR-PCR反應體系和擴增程序對長白落葉松105個單株基因組DNA進行PCR擴增，所得PCR產物利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，500 bp DNA Marker作為已知分子量的DNA標準樣品，使用1×TBE電泳緩沖液，設定恒壓200 V，電泳1.5 h，銀染法染色，在凝膠成像儀下成像。
1.2.5 數據統計與分析
對于電泳圖譜中的多態位點，每個SSR標記只統計目標片段范圍內的條帶，重復試驗中穩定出現的差異帶用于數據分析，按照片段由上到下順序，根據DNA標準樣品在凝膠上的指示位置，估計DNA樣品擴增產物的分子量大小，有帶記為1，無帶記為0。利用GenAlex 6.41、Popgen 32、Power marker和NTSYS-pc 2.10聚類軟件計算遺傳多樣性參數，包括觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）以及Shannon多樣性指數（I）;運用Power marker軟件計算群體多態性信息含量（PIC）;利用NTSYS-pc 2.10軟件構建UPGMA聚類圖;使用Structure 2.3.1軟件估計最佳群體群組數K值，并將數據上傳至Structure 2.3.1 Harvester軟件進行分析。GenAlex 6.41和Power marker利用位置與同一泳道GL500分子內標進行比較，得出SSR擴增產物長度進行計算，Popgen 32和NTSYS-pc 2. 10利用0-1二進制數據進行計算。引物通用率和多態性引物率計算公式如下：
引物通用率（%）=有擴增產物的引物對數/通用性檢測的引物對數×100。
多態性引物率（%）=擴增出多態條帶的引物對數/有擴增產物的引物對數×100[25]。
2 結果與分析
2.1 引物質量分析
2.1.1 引物通用性分析
利用270對SSR引物對長白落葉松105個單株進行PCR擴增，不同引物擴增得到的譜帶長度明顯不同，標記產物大小范圍為100～300 bp。108對引物可擴增出條帶，通用率為40.00%，50對引物具有多態性，多態性引物率為46.30%，不同樹種SSR引物在長白落葉松無性系中的通用性檢測結果見表3。與長白落葉松同為落葉松屬的20對華北落葉松引物，有19對在長白落葉松無性系中擴增出目的條帶，通用率為95.00%，其中有14對引物在長白落葉松無性系中檢測到多態性，多態性引物率為73.68%，而日本落葉松、興安落葉松分別有48對、7對引物在長白落葉松無性系中擴增出目的條帶，通用率分別為67.16%、28.00%，分別有30對、1對引物在長白落葉松無性系中檢測到多態性，多態性引物率分別為62.50%、14.28%。與長白落葉松親緣關系較遠的松屬的大別山五針松、華山松、紅松分別有4對、5對、12對引物在長白落葉松無性系中擴增出目的條帶，通用率分別為25.00%、14.70%、34.29%，分別有1對、1對、3對引物在長白落葉松無性系中檢測到多態性，多態性引物率分別為25.00%、20.00%、25.00%。比較下來，落葉松屬的引物通用率明顯高于松屬，說明SSR引物在落葉松屬中具有很好的普適性，在親緣關系相近的物種間可以共享同一SSR標記。
2.1.2 引物多態性分析
通過對引物通用性和穩定性的驗證，華北落葉松篩選出D2-D19[6]，日本落葉松篩選出RH1-RH8、RL2-RL11、RQ3-RQ10[11]，共30對SSR引物，對基因組DNA進行PCR擴增發現，在擴增帶類型、擴增帶數量和多態性檢出率等方面存在差異，簡單重復序列位點多態性分析結果見表4（以GenAlex 6.41計算為準）。30對引物共檢測到258對等位基因，每個位點的觀測等位基因數2～4個，平均觀測等位基因數（Na）為2.833，平均有效等位基因數（Ne）為1.814，平均觀測雜合度（Ho）為0.404，平均期望雜合度（He）為0.401，其中RQ4引物檢測到的等位基因數最多，Ne和He最大（分別為3.297和0.697），Shannon多樣性指數（I）最高（1.291）;RQ3位點的Ne和He最?。ǚ謩e為1.100和0.091），Shannon多樣性指數（I）最低（0.191）。平均Shannon多樣性指數（I）為0.694，平均PIC為0.354 1，其中PIC<0.25的位點有7個，為低度多態性位點;0.25
通常，種群內近交系數（Fis）代表觀測雜合度與期望雜合度之間的偏差程度，對群體交配系統具有重要意義[26]。根據Wright（1978）[27]關于Fis的計算公式：Fis=1-Ho/He，當Fis小于0時，則Ho>He，表明遠交產生的雜合體過多，出現雜合子過剩;當Fis大于0時，則HoSymbol|@@ He，表明近交產生的純合個體較多，出現純合子過剩。30個SSR位點的F統計量檢測結果顯示，Fis、Fit（群體總近交系數）分別為-0.049和-0.031，均為負值，群體表現出輕微雜合子過量，純合子不足，未出現近交衰退現象;基因流Nm平均值為286.232，遠高于自然群體，說明群體基因穩定性較低，基因交流頻繁;根據公式Nm=0.25（1-Fst）/Fst可知，每代遷入的有效個體數與群體間遺傳差異水平成反比，群體越穩定，度量群體間遺傳差異程度的Fst越大[28]，群體間遺傳分化系數Fst平均值為0.018，可見群體間遺傳分化程度較小。D122F754-E377-415C-80AE-3A2ED7EE363C
2.2 不同統計方法遺傳多樣性分析
采用不同統計方法分析遺傳多樣性差異，GenAlex 6.41、Popgen 32、Power marker軟件計算所得平均觀測等位基因數（Na）均為2.833，平均有效等位基因數（Ne）基本一致，平均觀測雜合度（Ho）Popgen 32略高于GenAlex 6.41，但平均期望雜合度（He）和平均Shannon多樣性指數（I）差異很小，平均Nei基因多樣性指數（H）則完全相同（表5）。利用SPSS統計軟件計算分析其差異是否顯著，平均觀測雜合度（Ho）符合正態分布，配對樣本t檢驗計算P值均小于0.05，平均期望雜合度（He）的P值以及平均Shannon多樣性指數（I）均為0，平均有效等位基因數（Ne）不符合正態分布，配對樣本的秩和檢驗計算得到P值為1，說明不同遺傳多樣性分析軟件的計算結果差異微小，本研究試驗數據具有較高可信度。
2.3 聚類分析
為進一步分析其中的親緣關系，根據長白落葉松種子園105個單株的遺傳一致度構建長白落葉松UPGMA聚類圖。如圖4所示，以0.692為閾值，可將105單株分為4個類群。105個單株間遺傳相似系數為0.518 5～0.923 1，平均遺傳相似度為0.720 4，遺傳距離為0～0.656 7，平均遺傳距離為0.336 8，說明選取的長白落葉松單株在分子水平上具有一定差異，其遺傳多樣性較豐富。長白落葉松105個單株中，第9單株與第72單株之間的遺傳相似度最?。?.518 5），遺傳距離最大（0.656 7），說明二者之間的遺傳差異最大。
2.4 群體遺傳結構分析
對長白落葉松種子園生產群體進行遺傳結構分析可知，lnP（D）隨著K值增加逐漸降低，lnP（D）在K=4時出現第1個轉折點，此時ΔK為最大值，如圖5所示，根據似然數最大原則確定最佳群體數目[29]，可將105個單株分為4個理論群組，意味著長
白落葉松種子園105個單株分化為4個不同基因型族。如圖6所示，橫坐標表示105個單株，縱坐標表示Q分布，長白落葉松被劃分為4亞群體：第一亞群包括單株25、84和27，第二亞群只包括單株89，第三亞群包括單株7、9、12、31、32、37、55、61、67、79、80、90，其余為第四亞群。
3 討論與結論
不同遺傳材料重復次數的可變性，導致SSR長度的高度變異性，這一變異性正是微衛星變異的實際遺傳基礎。物種之間DNA序列的同源性，使得不同物種間轉移使用SSR引物成為可能，已有試驗證明同科不同屬或更近物種間可共用某些SSR引物[30]。從近緣物種270對引物中篩選出108對引物，可以在40個長白落葉松無性系中成功擴增，通用率為40.00%，落葉松屬112對引物中有效引物45對，多態性引物率高達60.81%，松屬158對引物通用率為21.52%，多態性引物率為14.71%，其中與長白落葉松同為落葉松屬的華北落葉松、日本落葉松、興安落葉松引物通用率分別為95.00%、67.16%、28.00%，多態性引物率引物率分別為73.68%、62.50%、14.28%。這些引物幾乎在所有供試材料上均能擴增出與目的條帶大小相似的產物，但不同屬間SSR引物揭示的多態性水平不盡相同，表明本研究篩選的SSR引物表現出較高的通用性和多態性，屬間通用引物成功率主要依賴于屬間親緣關系遠近，與劉超等[12]開發的落葉松引物通用性檢測結果一致。本試驗篩選出30對有效引物，其中RQ4等位基因數最多，Ne和He最大，RQ3相比之下較低，也驗證了不同屬SSR引物雖然跨屬間高度擴增，但多態性水平存在差異。一個標記系統的交叉轉移程度決定其在其他遺傳研究中的適用性，應用多種DNA標記方法有助于從長白落葉松全基因組組織分化角度，更準確揭示長白落葉松的系統發育關系。本研究篩選的多態性SSR引物，特異性強且穩定性較好，對于目前只有少量SSR引物公布的落葉松屬樹種來說，豐富了現有分子標記資源，有助于落葉松屬種群遺傳結構、品種指紋圖譜構建以及種質鑒定等研究領域進一步發展，尤其對分析遺傳背景較近的資源意義重大。
從多種遺傳多樣性軟件計算得到的數據可以看出，每個位點的觀測等位基因數2～4個不等，平均觀測等位基因數（Na）均為2.833，有效等位基因數（Ne）為1.737 0～1.815 7，觀測雜合度（Ho）為0.383 0～0.617 3，期望雜合度（He）為0.371 0～0.404 4，Shannon多樣性指數（I）為0.654 0～0.693 9，平均PIC為0.354 1，說明種子園遺傳多樣性較高，無性系遺傳多樣性也未降低。姚宇[4]利用SSR分子標記對林口青山種子園38個長白落葉松無性系親代與子代遺傳多樣性進行分析，子代群體和親代群體的Shannon多樣性指數（I）分別為1.023 2和0.980 5，比本試驗利用30對SSR引物研究77區和78區共105個單株的遺傳多樣性（0.673）高，與長白落葉松種子園77區347個單株的ISSR遺傳多樣性相比，平均Shannon多樣性指數（I）略高于單株的0.436，分析其原因可能是長白落葉松無性系種子園存在部分砧木存活等情況，下一步將利用分子標記手段對種子園內無性系進行鑒定分析，也可能是不同數據統計方法存在一定誤差。與范英明[31]得到的20個華北落葉松天然群體的平均Shannon多樣性指數（0.787）相比，差異不明顯，說明種子園的無性系遺傳多樣性高。
在進行遺傳多樣性分析時，遺傳距離是反映遺傳變異水平和遺傳分化程度的重要指標，可為雜種優勢提供基本遺傳參數[32-33]。長白落葉松種子園105個單株的平均遺傳相似度為0.720 4，平均遺傳距離為0.336 8，說明其存在一定程度的遺傳差異。華北落葉松20個天然群體的平均遺傳距離為0.035 3[32]，日本落葉松無性系種子園按5個種源計算的遺傳距離為0.002～0.015[34]，長白落葉松種子園單株之間的遺傳距離與種源之間相比明顯要高得多。且從Structure 2.3.1的分析結果將其歸為4個類群，說明種子園的遺傳組成存在明顯差異，長白落葉松種內遺傳分化比較廣泛，無性系遺傳多樣性豐富，進一步表明種子園遺傳多樣性高，無性系分布配置合理。在后續的育種工作中，可以參考胡立平等[35]對長春長白落葉松種子園子代測定的方法，進一步研究林口青山長白落葉松種子園遺傳增益與遺傳多樣性的平衡點，有利于長白落葉松高輪次遺傳改良的發展，為營建多世代種子園奠定基礎。D122F754-E377-415C-80AE-3A2ED7EE363C
【參 考 文 獻】
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