水榆花楸中3種活性物質的提取工藝優化

姚遠 李占君 賈凱慧 楊逢建

摘 要：為探究水榆花楸中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷3種活性物質的最佳提取工藝，為其他化學成分提取提供參考依據，以水榆花楸葉片為原料，以表面活性劑十二烷基硫酸鈉水溶液為溶劑，采用超聲輔助提取法提取綠原酸、蘆丁、金絲桃苷3種活性物質，對超聲功率、超聲時間、超聲溫度、液料比和提取溶劑質量分數進行單因素試驗，根據試驗結果設計Box-Behnken響應面法優化提取工藝并進行驗證。結果表明，最佳提取工藝為超聲功率405 W、超聲時間 40 min、超聲溫度60 ℃、液料比20∶1（mL/g）、提取溶劑質量分數2%，該條件下綠原酸、蘆丁、金絲桃苷3種活性物質得率分別為2.13%±0.06%、0.54%±0.02%、0.19%±0.02%，與理論預測值2.14%、0.54%、0.19%一致。相比索氏提取法，超聲輔助法提取水榆花楸中3種活性物質得率略有提高，優化所得提取工藝具有高穩定性、高得率等特點，應用前景較好。

關鍵詞：水榆花楸;活性物質;十二烷基硫酸鈉;超聲輔助提取;響應面法

中圖分類號：TQ645.1??? 文獻標識碼：A?? 文章編號：1006-8023（2022）03-0087-08

Optimization of Extraction Process of Three Active Substances

from Sorbus alnifolia

YAO Yuan1， LI Zhanjun2， JIA Kaihui1， YANG Fengjian1*

（1.Key Laboratory of Forest Plant Ecology， Ministry of Education， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China;

2.Yichun Branch of Heilongjiang Academy of Forestry， Yichun 153000， China）

Abstract：In order to study the extraction technology of chlorogenic acid， rutin and hyperin from the leaves of Sorbus alnifolia， and provide reference for the extraction of other chemical components， the leaves of Sorbus alnifolia were used as raw materials， and the surfactant sodium dodecyl sulfate aqueous solution was used as solvent to extract three active substances， chlorogenic acid， rutin and hyperin by ultrasonic assisted method. Based on five single factor experiments of ultrasonic power， ultrasonic time， ultrasonic temperature， liquid-material ratio and mass fraction of extraction solvent， the Box-Behnken response surface method was designed to optimize the extraction process and verified. Results showed that： the optimum process parameters were determined as follows： ultrasonic power 405 W， ultrasonic time 40 min， ultrasonic temperature 60 ℃， liquid-solid ratio 20∶1（mL/g）， extraction solvent mass fraction 2%. The yields of chlorogenic acid， rutin and hyperin were 2.13%±0.06%， 0.54%±0.02% and 0.19%±0.02%， which was consistent with the theoretical predicted values of 2.14%， 0.54% and 0.19%. Compared with Soxhlet extraction， the yield of three active substances in Sorbus alnifolia was slightly improved. The optimized extraction process has the characteristics of high stability and high yield， and has a good application prospect.

Keywords：Sorbus alnifolia; active substance; sodium dodecyl sulfate; ultrasonic assisted extraction; response surface method

0 引言

水榆花楸（Sorbus alnifolia），別名黃山榆、花楸、楓榆、千筋樹和黏棗子等，為薔薇科（Rosaceae）花楸屬（Sorbus）落葉喬木，主要分布在我國長江流域、黃河流域和東北中南部，生長于環境濕潤的山坡、山溝或山頂混交林或灌木叢中。水榆花楸樹干通直，高可達20 m;小枝圓柱形，冬芽卵形，先端急尖，外具數枚暗紅褐色無毛鱗片;葉片呈卵形或橢圓卵形，先端短漸尖，側脈直達葉邊齒尖;葉柄無毛或微具稀疏柔毛;樹冠圓錐形，秋季葉片轉變成猩紅色，為美麗觀賞樹。因其形態高大且具觀賞價值，常被種植用來美化環境[1]。17589BAA-E2B5-40FB-90F3-838AB5FB2438

近年來，花楸屬植物的藥用價值逐步受到關注[2]，主要是因為其枝葉、花、果實種子含有較豐富的黃酮類化合物及多種活性物質，其中綠原酸、蘆丁和金絲桃苷等活性物質具有清熱解毒、消炎、降低膽固醇、抗腫瘤和抗氧化等功效，在藥物研發方面有重要價值[3-7]。現階段，對花楸屬植物的研究主要是從黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）和百華花楸（Sorbus pohuashanensis）果實中提取黃酮類物質，關于水榆花楸的活性物質提取分離、結構鑒定等鮮見報道。

超聲輔助提取是在溶劑萃取法基礎上發展起來的一種新興萃取工藝，其克服了蒸氣蒸餾法、索式提取法和回流提取法等傳統提取方法工序繁雜、耗時長和損失大[8]等不足，具有成本低、操作簡便和得率高等特點[9-10]，綠原酸、蘆丁和金絲桃苷等活性物質在植物或藥物中主要采用有機溶劑直接提取或超聲輔助提取[11-14]。表面活性劑是近年來興起的提取溶劑，其能夠降低液體表面張力且具有特殊的兩親分子結構，相比有機溶劑可更大程度使提取物質溶解在溶液中，有效提高提取效率[15-18]。鑒于此，本研究以水榆花楸葉片為原料，以表面活性劑十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS）水溶液為溶劑，采用超聲輔助法提取綠原酸、蘆丁和金絲桃苷3種活性物質，對超聲功率、超聲時間、超聲溫度、液料比和提取溶劑質量分數進行單因素試驗，根據試驗結果設計Box-Behnken響應面法優化提取工藝并進行驗證，旨在探究水榆花楸中綠原酸、蘆丁和金絲桃苷3種活性物質的最佳提取工藝，為其他化學成分提取提供參考依據。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

水榆花楸葉片采自東北林業大學校園內并經專家鑒定;綠原酸、蘆丁、金絲桃苷標準品，純度大于等于90%，上海源葉生物科技有限公司;超純水，實驗室自制;磷酸分析純，天津天力化學試劑有限公司;色譜級乙腈和甲醇，SK公司;十二烷基硫酸鈉（SDS），天津百倫斯生物技術有限公司。

1.2 儀器

高效液相色譜儀，型號1260，美國安捷倫公司;電子分析天平，型號UH620H，日本SHIMADZU島津;醫用離心機，型號H1650，長沙市高新技術產業開發區湘儀離心機器有限公司;數控超聲清洗機，型號JP-100ST，深圳市潔盟清洗設備有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱，型號DHG-9145A，上海一恒科技有限公司;80目標準篩。

2 ?試驗方法

2.1 供試品溶液制備

水榆花楸葉片置于50 ℃干燥箱內干燥24 h，粉碎獲得80目粉末備用。精確稱取1.0 g粉末于50 mL離心管中，加入20 mL，2%十二烷基硫酸鈉水溶液，在不同超聲功率、超聲時間和超聲溫度條件下制備提取液并冷卻至室溫，10 000 r/min高速離心10 min，取0.25 mL上清液加入0.75 mL甲醇稀釋4倍后即為供試品溶液。

2.2 液相色譜條件

Diamonsil-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm×5SymbolmA@m）。綠原酸、蘆丁、金絲桃苷檢測條件：流動相A為乙腈，流動相B為0.6%磷酸水溶液，柱溫30 ℃，檢測波長360 nm;流速0.8 mL/min;進樣量20 μL;梯度洗脫，洗脫程序見表1[19]。

2.3 標準曲線建立

將綠原酸、蘆丁、金絲桃苷標準品分別溶于甲醇中，得到質量濃度為1 mg/mL的標準母液，用甲醇將母液依次稀釋成6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL標準溶液。應用高效液相色譜法測定，以標準品質量濃度為橫坐標、以峰面積為縱坐標繪制標準曲線，并進行回歸分析，最終得到綠原酸的回歸方程為y=3 726.9x+21.567（R2=0.999 1），線性范圍6.25～200 μg/mL;蘆丁的回歸方程為y=4 484.8x-74.247（R2=0.999 5），線性范圍6.25～200 μg/mL;金絲桃苷的回歸方程為y=5 937.6x-131.68（R2=0.999 0），線性范圍6.25～200 μg/mL。標準品及樣品色譜如圖1所示。

2.4 供試品得率測定

將供試品溶液測得峰面積代入標準曲線，分別計算水榆花楸葉片中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷3種活性物質得率，公式為

Y=（M1/M2）×100%。

式中：Y為活性物質得率（%）;M1為提取活性物質質量算術平均值，g;M2為水榆花楸葉片粉末質量，g。

2.5 數據統計與處理

采用Origin 2018和Design Expert 10軟件進行數據統計與處理。

2.6 單因素試驗

稱取干燥水榆花楸葉片粉末1 g，2%十二烷基硫酸鈉水溶液為提取溶劑，超聲時間30 min，超聲溫度40 ℃，液料比20∶1（mL/g），研究超聲功率200、300 、400 、500 、600 W對得率的影響。稱取干燥水榆花楸葉片粉末1 g，2%十二烷基硫酸鈉水溶液為提取溶劑，超聲功率400 W，超聲溫度40 ℃，液料比20∶1 （mL/g），研究超聲時間10、20、30、40、50 min對得率的影響。稱取干燥水榆花楸葉片粉末1 g，2%十二烷基硫酸鈉水溶液為提取溶劑，超聲功率400 W，超聲時間30 min，液料比20∶1 （mL/g），研究超聲溫度30、40、50、60、70 ℃對得率的影響。稱取干燥水榆花楸葉片粉末1 g，2%十二烷基硫酸鈉水溶液為提取溶劑，超聲功率400 W，超聲時間30 min，超聲溫度40 ℃，研究液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 （mL/g）對得率的影響。稱取干燥水榆花楸葉片粉末1 g，超聲功率400 W，超聲時間30 min，超聲溫度40 ℃，液料比20∶1 （mL/g），研究十二烷基硫酸鈉水溶液質量分數1.2%、1.6%、2%、2.4%、2.8%對得率的影響。17589BAA-E2B5-40FB-90F3-838AB5FB2438

2.7 響應面法優化提取工藝

根據單因素試驗結果，選取超聲功率、超聲時間、超聲溫度3個自變量，設計三因素三水平Box-Behnken Design優化試驗，以得率為響應值，響應面因素水平見表2。

2.8 對比試驗

采用索氏提取法進行對比，稱取水榆花楸粉末5.0 g，提取溶劑為70%乙醇溶液，液料比20∶1（mL/g），提取時間4 h，10 000 r/min離心10 min后取上清液作為待測溶液。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果分析

圖2為不同因素對水榆花楸3種活性物質得率的影響分析圖。

3.1.1 超聲功率對得率的影響

由圖2（a）可知，超聲功率從200 W升至600 W，綠原酸、蘆丁和金絲桃苷3種活性物質得率呈先升高后下降的趨勢，當超聲功率為400 W時，得率均達最大值，超過400 W后得率開始下降。這是因為隨著超聲波機械震蕩作用逐漸加強，提取溶劑可加速進入植物細胞中，同時超聲波的空化效應促進葉片組織完全分解破裂，使細胞內容物完全釋放溶出，且強烈的超聲波熱效應產生更高熱量，使細胞內溶質的溶解度增大[20];隨著超聲功率繼續增大，大部分雜質溶解，影響提取物質溶解度，導致得率下降。綜合考慮，選取300～500 W 超聲功率進行后續優化。

3.1.2 超聲時間對得率的影響

由圖2（b）可知，綠原酸活性物質得率在超聲時間10～20 min先下降，20～40 min再升高，40～50 min再下降;超聲時間從10 min 升至50 min，蘆丁和金絲桃苷2種活性物質得率呈先升高后下降的趨勢，當超聲時間為40 min時，得率均達最大值，超過40 min后得率開始下降。這是因為超聲時間過短，提取溶劑與葉片粉末未達到完全浸潤[21]，細胞破碎程度小，活性成分無法擴散到提取溶劑中;隨著超聲時間繼續延長，活性物質被部分氧化和分解，導致得率下降[22]。綜合考慮，選取30～50 min超聲時間進行后續優化。

3.1.3 超聲溫度對得率的影響

由圖2（c）可知，超聲溫度從30 ℃升至70 ℃，綠原酸、蘆丁和金絲桃苷3種活性物質得率呈先升高后下降的趨勢，當超聲溫度為60 ℃時，得率均達最大值，超過60 ℃后得率開始下降。這是因為超聲溫度升高，可加快分子擴散速率，促進活性物質析出[23];隨著超聲溫度繼續升高，溶劑部分揮發，導致得率下降。綜合考慮，選取50～70 ℃超聲溫度進行后續優化。

3.1.4 液料比對得率的影響

由圖2（d）可知，液料比從10∶1（mL/g）升至30∶1（mL/g），綠原酸、蘆丁和金絲桃苷3種活性物質得率呈先升高后緩慢下降的趨勢。這是因為液料比較小，提取溶劑不能完全浸潤材料，活性物質無法完全提取出來 [21];當液料比達20∶1（mL/g）時，葉片粉末與提取溶劑的接觸面積增大，促進活性物質析出;液料比進一步增大，溶質全部溶解，其他物質溶出[24]，導致得率下降。綜合考慮，選取20∶1 （mL/g）液料比進行后續優化。

3.1.5 提取溶劑質量分數對得率的影響

由圖2（e）可知，提取溶劑質量分數從1.2%升至2.8%，綠原酸、蘆丁和金絲桃苷3種活性物質得率呈先升高后下降的趨勢，當提取溶劑質量分數為2%時，得率均達最大值。這是因為綠原酸等活性物質極性較弱，適當增加表面活性劑質量分數可降低溶劑極性，有利于活性物質溶出;但隨著表面活性劑質量分數繼續增大，對活性物質的增溶作用不再增強，溶液中形成的膠束處于飽和狀態，活性物質進入膠束溶出受到阻礙[25]，導致得率下降后趨于平緩。綜合考慮，選取質量分數2%的十二烷基硫酸鈉水溶液進行后續優化。

3.2 響應面優化提取工藝

3.2.1 模型建立與顯著性檢驗

根據單因素試驗結果設計三因素三水平Box-Behnken Design優化試驗，見表3，對表3試驗數據進行多元回歸擬合，可得：

綠原酸得率回歸方程為Y1（%）=2.14-0.02A+4.43×10-3B+5.90×10-3C+1.61×10-3AB+0.01AC+1.69×10-3BC-0.11A2-0.09B2-0.08C2;

蘆丁得率回歸方程為Y2（%）=0.54+0.01A+4.87×10-3B+0.01C+5.35×10-3AB-2.10×10-3AC+6.36×10-4BC-0.04A2-0.09B2-0.06C2;

金絲桃苷得率回歸方程為Y3（%）=0.19+2.40×10-3A+1.21×10-3B+1.87×10-3C+1.52×10-3AB+4.55×10-4AC+5.05×10-5BC-5.64×10-3A2-0.01B2-0.01C2。

對回歸方程進行方差分析，由表4可知，3個模型F分別為48.51、39.03、27.71，P均小于0.01，說明模型差異極顯著，其中A2、B2、C2對綠原酸、蘆丁和金絲桃苷3種活性物質得率影響極顯著，A對3種活性物質得率影響顯著，C對蘆丁得率影響顯著，其他因素二者之間的交互作用均不顯著。失擬項P分別為0.05、0.05、0.06，表明差異不顯著，模型計算所得得率與試驗值無明顯差異。對多項式進行回歸分析，決定系數（R2）分別為0.984 2、0.980 5、0.972 7，校正系數（Adj. R2）分別為0.963 9、0.955 3、0.937 6，均大于 0.90，見表5，表明模型擬合度良好，響應面適合后續優化。

3.2.2 因素交互影響及等高線分析

由圖3可知，各因素之間交互作用對水榆花楸中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷3種活性物質影響的響應面均為向下曲面，曲面越陡，表明交互作用越明顯，隨著各因素參數值增大，得率呈先增大后減小的趨勢。響應面底部為等高線投影，圖3（a）、圖3（b）等高線為橢圓形，圖3（c）等高線近乎圓形，表明綠原酸AB、AC的交互作用比BC的交互作用顯著;圖3（d）等高線橢圓形扁平程度最大，表明蘆丁AB的交互作用最顯著;圖3（g）等高線為橢圓形，表明金絲桃苷AB的交互作用最顯著，與表4方差分析結果一致。17589BAA-E2B5-40FB-90F3-838AB5FB2438

3.2.3 優化提取參數和驗證試驗

通過回歸模型分析可知，最佳提取工藝參數為超聲功率405.64 W、超聲時間40.35 min、超聲溫度60.78 ℃，該條件下綠原酸得率為2.14%、蘆丁得率為0.54%、金絲桃苷得率為0.19%。考慮到試驗可操作性以及儀器精密度，調整參數為超聲功率405 W、超聲時間40 min、超聲溫度60 ℃。利用調整后的最佳提取工藝進行重復性試驗，綠原酸得率為2.13%±0.06%、蘆丁得率為0.54%±0.02%、金絲桃苷得率為0.19%±0.02%，與理論預測值吻合度較高，表明優化后的條件切實可行。

3.2.4 對比試驗

對比表6中2組數據可知，相比較索氏提取法，表面活性劑結合超聲輔助提取法優化的提取工藝3種活性物質得率均有提高，且具有操作簡單、提取時間短、耗能少的優勢。

4 結論與討論

本研究將表面活性劑與超聲輔助提取方法相結合，以水榆花楸葉片為原料，在單因素試驗基礎上，采用響應面法進行優化分析，確定最佳提取工藝參數為超聲功率405 W、提取時間40 min、超聲溫度60 ℃、液料比為20∶1（mL/g）、提取溶劑質量分數2%，該條件下綠原酸、蘆丁和金絲桃苷3種活性物質得率分別為2.13%±0.06%、0.54%±0.02%、0.19%±0.02%，與理論預測值2.14%、0.54%、0.19%一致，遠高于孟令鍇等[1]測定百華花楸果實中的金絲桃苷和蘆丁得率，金絲桃苷得率是其10倍，蘆丁得率是其5倍。相比索氏提取法，超聲輔助法提取水榆花楸中3種活性物質得率略有提高，優化所得提取工藝具有高穩定性、高得率等特點，應用前景較好。

【參 考 文 獻】

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