不同桑樹品種響應干旱脅迫的比較轉錄組學分析

曾睿　任迎虹　祁偉亮　黃仁維　李戀龍　李鑫鑫　王飛　趙比黑

摘要：【目的】發掘響應干旱脅迫的關鍵抗旱基因，從轉錄水平上揭示桑樹的抗旱分子機制，為后續開展桑樹分子抗旱性育種工作提供科學依據。【方法】以干旱敏感性品種德果1號和耐旱性品種湖桑32號為研究對象，通過盆栽種植方式開展干旱脅迫及復水處理試驗，采集24個桑葉樣本提取總RNA后構建cDNA文庫，在Illumina HiSeqTM 4000測序平臺上進行高通量測序，并結合生物信息學對相關基因進行注釋分析。【結果】經轉錄組測序，各樣本的Clean reads范圍為45723096～67280168條，有效堿基數（Clean bases）集中在6.86～10.09 Gb，GC含量在44.84%～46.48%（平均為45.61%），Q30在90.36%～93.07%。差異表達基因（DEGs）篩選結果顯示，6個差異分組（A2 vs A1，B2 vs B1，A3 vs A1，B3 vs B1，A4 vs A1，B4 vs B1）分別篩選出3510、3399、5677、5507、5124和2734個差異表達基因;經干旱脅迫處理后，桑葉功能組基因中呈下調表達的差異表達基因明顯多于呈上調表達的差異表達基因，說明桑樹在生長過程中存在不同的功能基因以控制桑葉生長發育。不同抗旱性桑葉轉錄組測序數據中以涉及生物學過程的差異表達基因最多，且主要集中在小分子代謝過程（Small molecule metabolic process）、跨膜運輸（Transmembrane transport）及碳水化合物代謝過程（Carbohydrate metabolic process）等方面;與分子功能相關的差異表達基因次之，主要涉及轉移酶活性（Transferase activity）和水解酶（Hydrolase activity）等。干旱脅迫下不同抗旱性桑葉差異表達基因主要富集到59條KEGG信號通路上，可劃分為代謝、遺傳信息處理、環境信息處理、細胞過程和生物系統五大信號通路;其中，抗旱性桑樹品種通過提高能量代謝、碳水化合物代謝、增強光合作用及脂質代謝來更好地適應干旱脅迫。綜合GO功能注釋分析和KEGG信號通路富集分析，得到以下可能與干旱相關的基因：LOC21410404、LOC21404884、LOC21409623、LOC21401352、LOC21398977、LOC21388561、LOC21401447、LOC21398764、LOC21385254、LOC21384661、LOC-21410404及LOC21408971。【結論】不同桑樹品種的耐旱性存在顯著差異，其中抗旱性桑樹品種是通過提高能量代謝、碳水化合物代謝、脂質代謝及光合作用共同應對干旱脅迫。

關鍵詞：桑樹;干旱脅迫;抗旱性;轉錄組;差異表達基因

中圖分類號： S888.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）03-0684-09

Comparative transcriptome analysis of drought stress responses in mulberries of differing drought resistances

ZENG Rui， REN Ying-hong QI Wei-liang， HUANG Ren-wei， LI Lian-long，

LI Xin-xin， WANG Fei， ZHAO Bi-hei

（College of Chemistry and Life Science， Chengdu Normal University， Chengdu， Sichuan? 611130， China）

Abstract：【Objective】To identify drought-resistance genes operating in mulberry under drought stress and reveal the molecular mechanism of drought resistance in mulberry at the transcriptional level， so as to provide a theoretical basis to support the breeding for and the selection of drought-resistance in mulberry. 【Method】The drought-sensitive mulberry variety of Deguo 1 and drought-tolerant mulberry variety Husang 32 were used as the research materials. The drought stress and the control group of rehydration treatment were carried out through pot cultivation. Total RNA was extracted from 24 mulberry leaf samples， cDNA libraries was constructed， and then subject to high-throughput sequencing on the Illumina HiSeqTM 4000 platform. Drought-related genes were annotated and analyzed in combination with bioinformatics. 【Result】The results showed that clean reads ranged from 45723096 to 67280168， with clean bases concentrated in 6.86 Gb to 10.09 Gb， with a GC content of 44.84%-46.48% （average 45.61%） and Q30 scores of 90.36%-93.07%. The number of differentially expressed genes （DEGs） between samples （A2 vs A1， B2 vs B1， A3 vs A1， B3 vs B1， A4 vs A1， B4 vs B1） were：3510，3399，5677，5507，5124 and 2734， respectively. There were a smaller number of up-regulated genes than down-regulated genes after drought stress treatment of mulberry. DEGs between the mulberries of differing drought resistance were most enriched in biological processes， consisting mainly of small molecule metabolic process， transmembrane transport and carbohydrate metabolic process. DEGs involved in molecular function were the second most enriched， consisting mainly of transferase activity and hydrolase activity. DEGs were enriched in 59 KEGG signaling pathways， which can be divided into five categories： metabolism， genetic information processing， environmental information processing， cellular processes and biological systems. Drought-resistant mulberry varieties could better adapt to drought stress by their increased expression of genes involved in energy metabolism， carbohydrate metabolism， photosynthesis and lipid meta-bolism. GO functional annotation and KEGG signal pathway enrichment analyses were combined to obtain the drought-resistance genes：LOC21410404，LOC21404884，LOC21409623，LOC21401352，LOC21398977，LOC21388561， LOC21401447， LOC21398764， LOC21385254， LOC21384661， LOC21410404 and LOC21408971. 【Conclusion】 The higher drought tolerance of the mulberry variety Husang 32 relative to the variety Deguo 1 involved significant differential expression of genes under drought stress related with enhancements in energy metabolism， carbohydrate metabolism， photosynthesis and lipid metabolism.D469D8A7-8DA9-4B0F-AA21-212FF56397DA

Key words： mulberry （Morus alba L.）; drought stress; drought-resistant; transcriptome; differentially expressed genes （DEGs）

Foundation items： Sichuan Science and Technology Project （2018JY0442）; Sichuan Higher Education Talent Cultivation Quality and Education Reform Project （JG2018-888，JG2018-885）; The University-level Innovation Project of Chengdu Normal University （CSCXTD2020A04）

0 引言

【研究意義】桑樹（Morus alba L.）隸屬于桑科（Moraceae）桑屬（Morus），為典型的落葉型多年生深根性木本植物（杜偉等，2016，2017;劉丹等，2020）。桑樹的深根性決定其水分主要借助于自身強大的根群系統，一旦遇到水分缺乏則會嚴重影響桑樹的生長發育，尤其是在氣溫相對較高夏秋季。攀西地區是我國重要的蠶桑生產基地，蠶桑產業發展對促進當地農民增收及水土保持具有重要意義。但受制于攀西地區的特殊地理位置，常出現大規模、持續性的干旱，給桑樹的生長發育帶來嚴重威脅，進而制約著蠶桑產業的可持續發展（Liu et al.，2019c）。因此，深入全面開展桑樹干旱脅迫機理研究，不僅有利于促進桑樹的育種創新，對保障我國蠶桑產業的健康發展也具有重要意義。【前人研究進展】大多數植物在遇到干旱或水分不足的情況下均會借助復雜的生理代謝和細胞過程以確保及維系自身生長發育（李捷等，2019;林艷華等，2019;徐瀾等，2020），其中存在大量的細胞基因轉錄，因此，基于轉錄組學從整體角度對植物細胞內基因轉錄及基因調控進行系統研究，對深入了解干旱脅迫下的分子機制及挖掘抗旱基因具有重要意義，進而為培育高抗逆性品種提供理論依據（Bokonon-Ganta et al.，2013）。已有研究針對馬鈴薯（Zhang et al.，2014）、小麥（Liu et al.，2015;Kumar et al.，2018）、油菜（Dong et al.，2017）、花生（Zhao et al.，2018）及玉米（姚啟倫等，2021）等作物在干旱脅迫下的轉錄組學進行深入分析，鑒定出相應的干旱脅迫應答基因，并證實這些差異表達基因主要富集在氧化磷酸化、光合作用和植物代謝途徑中，但有關轉錄組學在桑樹抗旱方面的研究報道較少。Wei等（2014）基于川桑基因組數據庫的全基因組分析克隆了10個MnMAPK基因，結果表明MnMAPK基因可能參與桑樹的缺水脅迫途徑，但未發現干旱脅迫應答的調控途徑;周宏（2017）以桑樹育71-1品種為材料，初步明確了桑樹trihelix、bZIP、MYB和ERF轉錄因子家族成員在干旱脅迫中的表達變化規律;Li等（2017）通過高通量測序技術研究桑樹抗旱的關聯miRNA及其靶基因，證實miR156、miR172和miR39家族靶基因在干旱脅迫下發揮重要作用。此外，有研究發現MRD22基因（Wang et al.，2014）、EIL3基因（Liu et al.，2019a）、PPO1基因（Liu et al.，2019b）等在桑樹干旱脅迫下的表達量有所改變。【本研究切入點】隨著川桑全基因組序列的公布，越來越多學者將研究重點轉移到桑樹抗性基因，有關桑樹耐旱分子機制的研究已有較多報道（劉丹等，2020），但鮮見基于轉錄組測序技術對干旱脅迫下桑樹基因的表達水平進行動態跟蹤分析。【擬解決的關鍵問題】基于高通量測序對桑樹干旱脅迫及復水處理階段的基因表達模式進行研究，發掘響應干旱脅迫的關鍵抗旱基因，并結合生物信息學對相關基因進行注釋分析，從轉錄水平揭示桑樹抗旱的分子機制，為后續開展桑樹分子抗旱性育種工作提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試桑樹品種[干旱敏感性品種德果1號（GS），耐旱性品種湖桑32號（HS）]由成都師范學院化學與生命科學學院提供。試驗試劑主要有TRIzol試劑盒（美國Invitrogen公司）及TruSeq RNA Sample Prep Kit v2（美國Illumina公司）。主要設備儀器：Agilent 2100生物分析儀（G2939AA），Illumina HiSeqTM 4000測序儀，Eppendorf Centrifuge 5418離心機。

1. 2 試驗設計及取樣

采用10 L營養土塑料盆栽種植方式，每盆種植4株桑樹幼苗，于出苗后選取長勢一致的德果1號和湖桑32號各24盆（株高約45 cm）。試驗設4個處理（表1），每處理重復6次，水分處理分別為對照處理（CK）（正常供水85%）、輕度干旱脅迫（土壤田間含水量為65%～75%）、重度干旱脅迫（土壤田間含水量為35%～40%）和復水處理。采用烘干稱重法測定含水量，每天晚上20：00取土樣，當含水量達脅迫處理要求后，于次日上午8：00取植株樹冠同方位、同葉位的桑葉，經液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。取桑葉樣品進行總RNA提取，重復3次。

1. 3 RNA提取與cDNA文庫構建

所有桑葉樣品采用TRIzol試劑盒提取總RNA，具體過程參照其說明進行操作。根據構建cDNA文庫的要求進行RNA樣品純度及質量檢測，并精準定量檢測RNA濃度及其完整性。檢測合格的RNA樣品使用Oligo（dT）磁珠對mRNA進行富集，經Fragmentation緩沖液隨機打斷后，以此為模板借助六核苷酸隨機引物進行反轉錄，合成雙鏈cDNA，并在DNA聚合酶I體系下以dNTPs為原料合成cDNA第二鏈。使用試劑盒純化雙鏈cDNA，經末端修復和加poly（A）尾后連接測序接頭，采用AMPure XP Beads進行片段篩選（250～300 bp），通過PCR擴增富集構建cDNA文庫。cDNA文庫質量檢測合格后，在Illumina HiSeqTM 4000測序平臺上開展高通量測序工作。D469D8A7-8DA9-4B0F-AA21-212FF56397DA

1. 4 數據分析

原始序列（Raw reads）數據提交至NCBI序列讀取歸檔數據庫，根據比對效率（Mapped ratio）及有效序列（Clean reads）在參考基因組上分布情況進行質量審查;以確認合格的Clean reads為生物信息學分析樣品，進行新基因預測發掘及表達差異分析，基于GO和KEGG等數據庫進行差異表達基因（Diffe-rential expressed genes，DEGs）功能注釋分析，并以Origin 2018制圖。

2 結果與分析

2. 1 轉錄組測序質量

以德果1號和湖桑32號的桑葉組織為基礎，選取18個干旱處理樣本及6個對照樣本的RNA，共同構建cDNA文庫。對24個樣本的轉錄組測序數據進行統計分析，結果顯示各樣本的Clean reads數量為45723096～67280168條，有效堿基數（Clean bases）集中在6.86～10.09 Gb，GC含量在44.84%～46.48%（平均45.61%），Q30在90.36%～93.07%。Clean reads與桑葉參考基因組樣本的對比結果顯示，二者的Mapped ratio超過75.00%，即轉錄組測序結果可靠，能滿足后續研究的要求。

2. 2 干旱脅迫下不同抗旱性桑葉差異表達基因的表達情況

不同抗旱性桑葉響應干旱脅迫的差異表達基因表達模式見圖1。與CK相比，德果1號在輕度干旱脅迫下的差異表達基因共有3399個，其中上調基因1675個、下調基因1724個;在重度干旱脅迫下的差異表達基因共有5507個，其中上調基因2879個、下調基因2628個;復水處理后共產生2734個差異表達基因，其中上調基因1419個、下調基因1315個。與CK相比，湖桑32號在輕度干旱脅迫下的差異表達基因共有3510個，其中上調基因1546個、下調基因1964個;重度干旱脅迫下的差異表達基因共有5677個，其中上調基因2674個、下調基因3003個;復水后共產生5124個差異表達基因，其中上調基因2374個、下調基因2750個。德果1號和湖桑32號在不同干旱脅迫下的基因表達水平存在明顯差異，輕度干旱脅迫與重度干旱脅迫相比，2個品種桑葉的上調基因和下調基因數量均呈上升趨勢，德果1號的上升幅度分別為41.82%和34.40%，湖桑32號對應的上升幅度分別是42.18%和34.60%;重度干旱脅迫與復水相比，2個品種桑葉的上調基因和下調基因數量則呈明顯的下降趨勢，德果1號的下降幅度分別為50.71%和49.94%，湖桑32號對應的下降幅度分別是11.22%和8.42%。經干旱脅迫處理后，桑葉功能組基因中呈下調表達的差異表達基因明顯多于呈上調表達的差異表達基因，說明桑樹在生長過程中存在不同的功能基因以控制桑葉生長發育。所有桑樹幼苗在干旱環境下均呈現出萎蔫、發育遲緩等癥狀，以此應對水分的缺乏。

2. 3 桑葉差異表達基因的GO功能注釋分析結果

GO功能注釋分析在于表現樣本體內所有差異表達基因及其產物的表達情況和屬性，能真實反映6個比較組的生物學過程（Biological process）、分子功能（Molecular function）及細胞組分（Cellular component）三大功能。由圖2可知，A2 vs A1注釋到的差異表達基因共2141個，涉及生物學過程、分子功能、細胞組分的差異表達基因分別為1074個（占50.16%）、828個（占38.67%）和239個（占11.16%）;A3 vs A1注釋到的差異表達基因共3191個，涉及生物學過程、分子功能、細胞組分的差異表達基因分別為1665個（占52.18%）、1146個（占35.91%）和380個（占11.91%）;A4 vs A1注釋到的差異表達基因共3088個，涉及生物學過程、分子功能、細胞組分的差異表達基因分別為1554個（占50.32%）、977個（占31.64%）和557（占18.04%）;B2 vs B1注釋到的差異表達基因共1836個，涉及生物學過程、分子功能、細胞組分的差異表達基因分別為938個（占51.09%）、583個（占31.75%）和315個（占17.16%）;B3 vs B1注釋到的差異表達基因共2892個，涉及生物學過程、分子功能、細胞組分的差異表達基因分別為1419個（占49.07%）、1034個（占35.75%）和439個（占15.18%）;B4 vs B1注釋到的差異表達基因共1523個，涉及生物學過程、分子功能、細胞組分的差異表達基因分別為788個（占51.74%）、519個（占34.08%）和216個（占14.18%）。可見，不同抗旱性桑葉轉錄組測序數據中以涉及生物學過程的差異表達基因最多，且主要集中在小分子代謝過程（Small molecule metabolic process）、跨膜運輸（Transmembrane transport）及碳水化合物代謝過程（Carbohydrate metabolic process）等方面;與分子功能相關的差異表達基因次之，主要涉及轉移酶活性（Transferase activity）和水解酶（Hydrolase activity）等。

2. 4 桑葉差異表達基因KEGG信號通路富集分析結果

KEGG信號通路富集分析結果（表3）表明，不同抗旱性桑葉差異表達基因均富集到新陳代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic information processing）、環境信息處理（Environmental information processing）、細胞過程（Cellular processes）和生物系統（Bidogcial system）五大信號通路上，主要涉及到碳水化合物代謝、運輸和分解代謝、其他氨基酸代謝、次生代謝產物生物合成、能量代謝、糖的生物合成與代謝、脂質代謝、輔助因子和維生素代謝、萜類和聚酮類化合物代謝、核苷酸代謝、環境適應、轉錄及翻譯等。D469D8A7-8DA9-4B0F-AA21-212FF56397DA

干旱脅迫下不同抗旱性桑葉DEGs主要富集到59條KEGG信號通路上（圖3），表明干旱脅迫對桑葉的淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）、環境適應（Environmental adaptation）、脂肪酸降解（Fatty acid degradation）、碳代謝（Carbon metabolism）、半乳糖代謝（Galactose metabolism）、α-亞麻酸代謝（Alpha-linolenic acid metabolism）、糖酵解/糖異生（Glycolysis/gluconeogenesis）、亞油酸代謝（Linoleic acid metabolism）、甘油脂代謝（Glycerolipid metabolism）、脂肪酸代謝（Fatty acid metabolism）、β-丙氨酸代謝（Beta-alanine metabolism）、磷酸戊糖途徑（Pentose phosphate pathway）、抗壞血酸和藻酸鹽代謝（Ascorbate and aldarate metabolism）、纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解（Valine/leucine/isoleucine degradation）、果糖和甘露糖代謝（Fructose and mannose metabolism）、丙酮酸代謝（Pyruvate metabolism）、不飽和脂肪酸生物合成（Biosynthesis of unsaturated fatty acids）、核糖體（Ribosome）、光合作用（Photosynthesis）、光合生物中的碳固定（Carbon fixation in photosynthetic organisms）、植物激素信號轉導（Plant hormone signal transduction）、卟啉和葉綠素代謝（Porphyrin and chlorophyll metabolism）、乙醛酸和二元羧酸鹽代謝（Glyoxylic acid and dicarboxylate metabolism）等有明顯影響。與CK相比，輕度干旱脅迫下參與淀粉和蔗糖代謝的差異表達基因有36個，重度干旱脅迫下參與半乳糖代謝的差異表達基因有24個、參與糖酵解/糖異生的差異表達基因有39個、參與亞油酸代謝的差異表達基因有9個、參與甘油脂代謝的差異表達基因有26個、參與脂肪酸代謝的差異表達基因有27個、參與纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解的差異表達基因有20個、參與果糖和甘露糖代謝的差異表達基因有19個、參與丙酮酸代謝的差異表達基因有28個、參與不飽和脂肪酸生物合成的差異表達基因有10個。從差異表達基因在KEGG信號通路上的富集情況來看，抗旱性桑樹品種通過提高能量代謝、碳水化合物代謝、增強光合作用及脂質代謝來更好地適應干旱脅迫，在逆境中保持存活。綜合GO功能注釋分析和KEGG信號通路富集分析，得到以下可能與干旱相關的基因：LOC21410404、LOC21404884、LOC21409623、LOC21401352、LOC 21398977、LOC21388561、LOC21401447、LOC2139 8764、LOC21385254、LOC21384661、LOC21410404及LOC21408971。

3 討論

桑樹的生物學遺傳背景相當復雜，但其分子學研究基礎還很薄弱。植物對干旱脅迫的響應涉及生理、生物化學和分子變化等復雜的生物學過程，桑樹根系發達，能在干旱的貧瘠環境下生長，究其原因是桑樹能借助次生代謝和光合作用強化、能量代謝水平提升、植物激素信號轉換等有效應對干旱，但在實際種植過程中發現不同桑樹品種在抗旱機制上存在明顯差異。為此，本研究基于高通量測序對桑樹干旱脅迫及復水處理階段的基因表達模式進行分析，結果從6個差異分組（A2 vs A1，B2 vs B1，A3 vs A1，B3 vsB1，A4vsA1，B4 vs B1）分別篩選出3510、3399、5677、5507、5124和2734個差異表達基因，經GO功能注釋分析后得到的差異表達基因分別為2141、3191、3088、1836、2892和1523個。此外，經干旱脅迫處理的絕大多數桑葉功能基因呈下調表達趨勢，只有少數基因呈上調表達趨勢。說明桑樹在生長過程中存在不同的功能基因以控制桑葉生長發育。鞏檑等（2015）研究證實，基因表達上調是葉片對水分刺激的響應，基因表達下調則是對干旱脅迫的響應。無論是動物還是植物，其新陳代謝最核心的特征就是能量代謝，以植物為例主要集中在光合作用、氧化磷酸化及碳固定、氮代謝等方面。受干旱脅迫的影響，絕大多數植物的光合速率呈下降趨勢，進而抑制光合作用和葉綠素生成。如干旱脅迫下楊樹葉片內涉及PS I和PS II、電子傳遞鏈基因表達水平出現不同程度的下調，而導致三羧酸循環明顯降低（Jia et al.，2020）。本研究也發現桑葉在干旱脅迫環境下其光合作用及光合—觸角蛋白代謝通路呈現明顯的富集現象，表明光合器官受到損害，光合速率及對應的產物產出受到抑制，與李慧娟等（2019）對小麥干旱脅迫的研究結論相似。

植物的生長發育過程離不開以碳水化合物代謝為首的生化過程。本研究結果表明，測序篩選出的桑葉差異表達基因以參與碳水化合物代謝為主，其中又以涉及淀粉和蔗糖代謝的差異表達基因下調表達為主。究其原因是桑葉在干旱環境下將淀粉降解為葡萄糖以調控植物滲透調節，更好地應對干旱脅迫（Liu et al.，2016）。脂質是生物膜的重要成分，植物質膜脂肪酸主要由棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸和亞麻酸組成，而膜脂組成成分的變化能反映植物對環境脅迫的響應程度。已有研究表明，干旱脅迫會導致馬鈴薯葉片中細胞膜和細胞壁的穩定強化基因上調表達，包括纖維素合成酶、果膠泛酸酶及脂質結合蛋白等編碼基因（Zhang et al.，2014）。本研究發現，干旱脅迫會影響桑葉中與脂肪酸降解和α-亞麻酸代謝相關的基因表達，通過保護細胞膜的流動性以緩解應對干旱脅迫，與李東等（2018）的研究結果一致，即α-亞麻酸能通過提高種子萌發過程中的α-淀粉酶活性來緩解干旱脅迫。由于作物品種及脅迫方式的不同，基因所調節的途徑也各不相同。趙雅杰等（2022）研究發現，向日葵在干旱脅迫下其植物激素信號轉導、蔗糖與淀粉代謝、氨基酸代謝有明顯的富集現象。萬麗云等（2018）對花生苗期進行干旱脅迫處理，KEGG信號通路富集分析發現花生是通過其發達根系系統、能量代謝、次生代謝和生長抑制等4個方面共同應對干旱脅迫。可見，在逆境脅迫下植物會通過基因調控作用以改變相關的代謝途徑。D469D8A7-8DA9-4B0F-AA21-212FF56397DA

4 結論

不同桑樹品種的抗旱性存在明顯差異，其中抗旱性桑樹品種是通過提高能量代謝、碳水化合物代謝、脂質代謝及光合作用共同應對干旱脅迫。

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（責任編輯 蘭宗寶）D469D8A7-8DA9-4B0F-AA21-212FF56397DA