慢性牙周病齦溝液中MAPK 的變化水平及意義

呂維志

（北京市大興區中西醫結合醫院口腔科 北京 100067）

牙菌斑中的微生物是引起慢性牙周炎的始動因子，首先引起牙齦出血，牙齦的炎癥，進而引起牙周支持組織的感染性炎癥的一類疾病，嚴重的牙周炎可以起起較深的牙周袋形成、附著性喪失和牙槽骨質的吸收進一步加重，最后可導致牙松動和牙拔除。牙齦發炎時，由于牙齦的腫脹和增生使牙齦緣的邊緣向牙冠方向移動，使牙齦溝加深，但是牙齦結合上皮的位置并沒有向根方遷移，為假性牙周袋。而患慢性牙周炎時，牙齦的結合上皮向根方增殖，其冠方牙齦與牙面分離，使齦溝加深而形成牙周袋，這是真性牙周袋。當然，臨床上的牙周袋常包含上述兩種情況，即牙周袋是由于牙齦緣向冠方移動以及溝底向根方延伸所形成的。牙周袋內含有菌斑、牙石、齦溝液、唾液粘蛋白、脫落上皮和白細胞等。慢性牙周炎是臨床最常見的疾病之一，它的發生機制是由于宿主的免疫防御機制與微生物之間的相互作用造成的。這種相互作用通過炎性因子所介導，而其中MAPK 信號通路在介導炎性因子發生、發展中起到很重要的作用。

MAPK，是把信號從細胞表面傳遞到細胞核內部的重要途徑之一。絲裂原活化蛋白激酶的簡稱，是一組能被細胞外的各種刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。 MAPK 信號轉導通路存在于所有真核細胞內，這一通路將細胞外刺激信號轉導至細胞核內，介導炎性因子的產生，參與細胞增殖、分化、癌變、轉移、凋亡等一系列生理過程，具有至關重要的作用。但目前對MAPK 在慢性牙周炎的發病機制中所起的作用觀點不一。本研究旨在檢測慢性牙周炎患者齦溝液中MAPK 的水平，以及牙周基礎治療對其的影響。

實驗試劑與儀器：牙周探針，超聲潔治器，超聲刮治器，手動刮治器，沖洗注射器，3%過氧化氫溶液，1%碘甘油，吸潮紙尖，電子天平，-70℃低溫冰箱，冷凍離心機，隔水式電熱恒溫培養箱。緩沖液全自動酶標儀：人絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），ELLISA試劑盒。洗板機：加樣槍。微型混合器：移液器恒溫水浴箱。

1 實驗對象

1.1 病例選擇

病例中慢性牙周炎的患者20 例，經與患者溝通后，且得到患者同意。對慢性牙周炎患者進行齦溝液的提取，同一患者、同一顆牙齒，選取牙周炎最嚴重的部位提取，并且記錄好該部位，經牙周基礎后，也要從相同的部位提取齦溝液，以便于對照。牙周健康者20 例。

1.2 納入標準

對照健康者：GI≤1，AL=0mm，PD≤3mm；慢性牙周炎組：GI＞1，AL≥3mm，PD≥4mm。

1.3 排除標準

有吸煙史、系統性疾病者，如糖尿病、風濕性關節炎、炎性腸病、肺部疾病、多發性硬化、肥胖、細菌、病毒和真菌系統感染者；3 個月內用過大量抗生素、糖皮質激素、非甾類抗炎藥免疫調節劑或避孕藥者；女性妊娠及哺乳期等。

1.4 實驗設計

首先篩選出符合納入標準的患者，然后進行全口牙周檢查，記錄牙周各項指標，拍攝全口曲面斷層片。提取待測牙的齦溝液。經過牙周基礎治療后，用雙氧水沖洗牙周，牙周內放碘甘油，口腔衛生宣教。然后6～8 周定期復查，再次在同一位點提取齦溝液，治療第12 周后拍片。所有牙周基礎治療、檢測記錄及液體樣本的采集均應由同一醫師完成,排除誤差。

1.5 實驗分組

組1：20 例牙周健康對照者。

組2：20 例慢性牙周炎患者。

組3：組2 中20 例慢性牙周炎患者進行牙周基礎治療后（齦上潔治及齦下刮治）。

2 齦溝液樣本的采集和保存方法

2.1 各組提取齦溝液的要求

組1 要確保足夠的量，GCF 從沒有炎癥的多位點收集。

組2 提取齦溝液的部位是口腔中牙周炎最嚴重的位點（附著喪失最嚴重的位點）。

組3 提取齦溝液的部位與組2 相同且在治療后6～8 周收集。

2.2 EP 管準備

0.5mlEP 管經過高溫高壓消毒后，吸潮紙尖也要經過物理（紫外線）消毒，把吸潮紙尖的尖端剪掉，裝在一個EP 管中，在電子天平上稱重并記錄。稱重后的重量減去收集齦溝液前記錄的重量，按比重換算成齦溝液的體積。

2.3 待測牙準備

三用氣槍吹干待測牙面和周圍牙齦黏膜約10秒，然后用棉球隔濕，此過程一直保持干燥，不能有水。

2.4 標本取樣

將消過毒的吸潮紙尖輕緩慢慢放入待測牙的B側和L 側的近中、中央、遠中6 個點位，遇到阻力即停止，在每個點位約停留30s 后取出，馬上將吸潮紙尖放入EP 管內，如果取齦溝液時，吸潮紙尖帶血、食物殘渣、上皮壞死脫落組織等，則丟之不用，再重新取。

2.5 保存樣本

超低溫冰箱保存備用。

3 齦溝液中MAPK 的檢測

3.1 檢測方法

采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）對齦溝液中MAPK 水平進行測量。ELISA 法定量可測定人血清、血漿、細胞培養血清或其它相關的生物液體中的MAPK 含量。

3.2 操作步驟

實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時均需混勻，混勻時盡量避免起泡，每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

4 結果

4.1MAPK 的濃度

患有牙周炎組，治療前齦溝液中MAPK 的平均水平是：191.68pg/ml；治療后齦溝液中MAPK 的平均水平是148.85pg/ml；健康對照組中MAPK 的平均水平是：139.40pg/ml。牙周炎治療前MAPK 明顯高于治療后，治療前牙周炎組MAPK 明顯高于健康對照組MAPK，治療后牙周炎組MAPK 與健康對照組無明顯差異，說明牙周炎通過牙周基礎治療后，齦溝液中MAPK 的濃度明顯下降了。

Tab1 健康對照牙齦齦溝液中和慢性牙周炎治療前MAPK 的比較

Tab2 慢性牙周炎治療前和治療后牙齦齦溝液中MAPK 的比較

Tab3 健康對照牙齦齦溝液中和慢性牙周炎治療后MAPK 的比較

4.2 臨床指標的變化

牙周炎組治療前，GI、PD、AL、BI 均明顯高于健康對照組，治療后的GI、PD、AL、BI 又明顯低于治療前，從側面也證實了經過牙周治療后，牙周炎的牙周情況已經明顯改善了。

Tab4 牙周炎組治療前和健康對照組臨床指標比較

Tab5 牙周炎組治療前和治療后臨床指標比較

5 討論

牙周炎是多因素參與的疾病，宿主對細菌挑戰的免疫應答反應是決定牙周炎是否發生，以及病情的輕重、范圍的大小、發展速度的快慢等必要因素之一。全身性疾患也可以對牙周炎有消極影響，如慢性糖尿病、Down 綜合征和白細胞異常功能等。再或者有一些環境和行為因素也將是危險因素，譬如精神壓力和吸煙。為了了解影響牙周炎的因素，近年來不少人致力于牙周炎的研究。本實驗，牙周炎的進程，影響齦溝液中MAPK 的表達，從而成為確診牙周炎的指標之一。

6 結論

6.1 慢性牙周炎經基礎治療后，臨床指標（GI、BI、PD、AL）都有顯著的變化，從側面證明牙周基礎治療是治療牙周疾病的方法之一。

6.2 牙周炎組的齦溝液中可以檢測到MAPK，并且濃度水平明顯高于健康對照組，說明MAPK 可能與牙周炎存在一定的正相關。

6.3 經治療后，MAPK 的濃度水平明顯低于治療前。再次一次證明，牙周炎病情的嚴重程度影響著MAPK 的表達水平。

6.4 絕大多數患者經過牙周基礎治療后，依從性較好，基本都按照正確的刷牙法，才能保持良好的口腔衛生，從而為牙周炎后期的維護提供了可靠的保證。

6.5 齦溝液中MAPK 的濃度與探針深度、附著喪失，在統計學上存在正相關關系。