應用CRISPR/Cas9 介導的基因編輯系統(tǒng)研究B 細胞中轉錄因子T-bet的調控作用

韓夏夏，顧霜霜，戴 黛，沈 南

上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院風濕科，上海風濕病學研究所，上海 200127

B 淋巴細胞是適應性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。B 細胞產生抗體，可以識別特異性的抗原，一方面通過抗體的中和作用，減少機體與病原體的接觸；另一方面抗體可以活化下游巨噬細胞和自然殺傷細胞等，通過抗體依賴的細胞毒作用（antibodydependent cellular cytotoxicity，ADCC），參與免疫反應［1］。抗體發(fā)揮效應功能不僅依賴于抗原結合片段（fragment of antigen binding，Fab）識別抗原，更需要通過抗體Fc（fragment crystallizable）端結合能表達抗體Fc 受體的效應細胞發(fā)揮差異性的免疫調控功能。抗體的Fc 端決定了抗體的類型［2-3］，Fc 端的轉變，即抗體的類別轉換，由細胞本身和微環(huán)境決定。抗原對B 細胞的激活、微環(huán)境中細胞因子的刺激等，最終由多種調控元件協(xié)同作用介導重鏈（IgH）位點的DNA 刪除實現抗體的類別轉換［1，4］。例如，受γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）誘導的轉錄因子T-bet （編碼基因為T-box 21，縮寫Tbx21）是IgG2a/c 類別轉換中重要的調控分子，在B 細胞中敲除Tbx21基因，能夠有效抑制IgG2a/c 抗體產生［5］。然而T-bet 對B 細胞類別轉換的精確調控機制仍不明確。

目前對B細胞調控分子和信號通路的研究大多通過基因工程的方式實現。傳統(tǒng)構建條件性基因敲除小鼠的方法主要是通過Loxp 位點和Cre 重組酶實現在小鼠體內B細胞中定向基因敲除，研究基因在體內外對B 細胞的調控功能；但該方法不僅花費時間較長，經濟成本較高，而且構建的模型小鼠還存在Cre 酶編碼序列部分被替代的可能，影響基因敲除的效率［6］。常規(guī)的體外功能研究技術包括：①通過小干擾RNA、微RNA 和發(fā)夾RNA 進行分子敲低，但其受到敲除效果穩(wěn)定性、瞬時性和敲除效率的影響。②通過病毒遞送過表達載體，但其受到基因大小的限制。近些年CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的基因編輯技術快速發(fā)展，得以應用于小鼠原代免疫細胞的基因編輯，可以靶向特定的目的基因，為研究分子轉錄提供了強有力的工具［7］。課題組前期成功利用Cas9轉基因小鼠和小向導RNA（small guide RNA，sgRNA）反轉錄病毒載體成功實現原代T細胞的基因敲除［8］。但該系統(tǒng)運用到B 細胞中時，需要考慮到B 細胞分化、激活條件的特異性，優(yōu)化質粒遞送體系，才能在B細胞基因的研究中也成功實現基因編輯。

本研究通過優(yōu)化病毒感染條件，利用濃縮的高滴度反轉錄病毒感染充分活化的小鼠原代B細胞，進行高效的基因編輯。以原代B細胞類別轉換中重要的轉錄調控分子T-bet 為例，利用該系統(tǒng)驗證敲除Tbx21基因對抗體IgG2c 產生的抑制作用，旨在為B 細胞基因功能研究提供一個簡單、快速、高效的基因編輯系統(tǒng)和研究手段。

1 對象與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器

1.1.1 實驗動物及細胞 8～10 周齡C57BL/6J 小鼠（JAX000664）和Cas9-EGFP 小鼠（JAX026175），雌性，體質量20～25 g，購自美國杰克森實驗室。所有實驗小鼠飼養(yǎng)在上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院SPF 級動物房，實驗動物使用許可證號為SYXK（滬）2018-0013。小鼠自由飲食，飼料用60Co 輻照殺菌。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～24 ℃，空氣相對濕度40%～60%，光照周期為12 h/12 h。

Plat-E 病毒包裝細胞購自中國科學院細胞庫。采用含10% 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 的DMEM 培養(yǎng)基，放置在37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞復蘇24 h后顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)和細胞密度，達到約80%密度即可傳代。本實驗中所用細胞為第3～4代指數生長期的細胞，細胞狀態(tài)良好。

1.1.2 主要試劑及儀器 小鼠B 細胞分選試劑盒、LS 分選柱（Miltenyi，德國），抗B 細胞受體（B cell receptor，BCR）抗體（Jackson Immunoresearch，英國），抗小鼠CD40 抗體（Biolegend，美國），Toll 樣受 體 （Toll-like receptor， TLR） 激 動 劑 R848（InvivoGen，美國），胰蛋白酶、Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基、DMEM、RPMI-1640、FBS、非必需氨基酸（non-essential amino acid，NEAA）、丙酮酸鈉、谷氨酰胺和抗生素（Gibco，美國），BD Cytofix/Cytoperm?細胞固定/破膜試劑盒（BD Biosciences，美國），Lipo2000 轉染試劑（ThermoFisher Scientific，美國），T4 連接酶（NEB，美國），血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（天根，中國），小鼠免疫球蛋白面板 （SBA Clonotyping System-C57BL/6-HRP，SouthernBiotech，美國），APC 標記的抗小鼠/人T-bet抗體（Clone 4B10）、PE/Cyanine 5 標記的抗小鼠CD19 抗體（Clone 6D5）、死活細胞染料（Zombie Aqua?Fixable Viability Kit，Cat#423102）、生物素標記的抗小鼠CD16/32 抗體（封閉抗體，Clone 93）（BioLegend，美國）。U6-PGK-Puro-BFP 載體由本實驗室自行構建。

超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、DNA Thermal Cycler 9700 PCR 儀（Thermo Scientific，美國）、Centrifuge 5801R 離心機（Eppendorf，德國），流式細胞分選儀Aria Ⅲ、 流 式 細 胞 分 析 儀Fortessa X-20 （BD Biosciences，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因集富集分析 使用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA） 軟件（Broad Institute）進行分析。經轉錄組測序（RNA-seq）得到的基因表達譜（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，FPKM）來自于GEO 公共數據庫的數據集GSE84948 和GSE83697。本研究分析所用的功能基因集均來源于Molecular Signatures Database（https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）。對于分析結果，一般認為|NES|>1，NOMP-value<0.05，FDRq-value<0.25（NES 是normalized enrichment score 的 縮 寫，NOM 是nominal 的 縮 寫，FDR 是false discovery rate 的縮寫）的通路下的基因集合是有意義的。

1.2.2 sgRNA/Cas9 表達載體的構建 sg-Tbx21和sg-NC 序列通過在線網站（http：//chopchop.cbu.uib.no/）設計，以單鏈的形式合成（序列見表1），并在以往的實驗結果中得到驗證［9-10］。選擇U6-PGK-Puro-BFP為sgRNA/Cas9 的表達載體，將其進行酶切電泳、回收得到線性載體。將合成的sgRNA 體外復性得到雙鏈后，通過T4 連接酶與上述酶切后的線性載體4 ℃連接過夜，然后進行轉化實驗，次日挑取單菌落進行測序。測序成功的菌株抽提質粒備用。

表1 sgRNA功能序列及單鏈引物Tab 1 sgRNA functional sequences and single strand primers

1.2.3 反轉錄病毒包裝 提前1 d，將8×106個Plat-E細胞種植在10 cm 培養(yǎng)皿，使用Lipo2000進行質粒轉染。取750 μL Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基，加入15 μg sgRNA 反轉錄病毒載體；另取750 μL Opti-MEM 加入30 μL Lipo2000，室溫孵育5 min。將這2步所得的混合液混勻，室溫放置15 min 后，加入培養(yǎng)皿中。轉染6 h后細胞換液，48 h后收集上清液，0.45 μm孔徑細胞濾網過濾后，4 ℃下20 133×g離心濃縮2 h，置于4 ℃冰箱備用，1周內使用。

1.2.4 B 細胞分離及體外激活培養(yǎng) 分離8～10 周齡的C57BL/6J 小鼠和Cas9-EGFP 小鼠脾臟，經研磨和40 μm 孔徑濾網過篩后得到細胞混合液，離心后裂解紅細胞。按照小鼠B細胞分選試劑盒說明書分離小鼠初始B 細胞。每107個脾臟總細胞用40 μL 預冷的磁珠活化細胞分選（MACS）緩沖液重懸，加入10 μL生物素標記的混合抗體（biotin-antibody cocktail），混勻，4 ℃反應5 min。然后按每107個脾臟總細胞加入30 μL 預冷的MACS 緩沖液，再加入20 μL 抗生物素磁珠，混勻，4 ℃反應10 min。等待間隙，將LS分選柱放置在磁力架上，用1 mL 的MACS 緩沖液預先潤洗2～3 次。將細胞加到LS 柱里，用15 mL 離心管收集LS 柱流下的細胞液，再用MACS 緩沖液沖洗LS 柱3 次。將所有LS 柱流下的液體于4 ℃下400×g離心5 min。去上清液后，培養(yǎng)基重懸進行細胞計數，之后于24 孔板（1×106個/孔） 內激活B 細胞，用500 ng/mL R848、1 μg/mL抗CD40抗體和1 μg/mL抗BCR抗體刺激24 h。

1.2.5 反轉錄病毒感染小鼠B細胞 收取激活后的B細胞，計數，再次鋪板，每孔2×105個細胞，并加入200 μL病毒和聚凝胺的混合液；32 ℃，1 260×g離心90 min。離心結束后，放入37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。6 h 后棄去病毒上清液，加入B 細胞分化培養(yǎng)基（RPMI-1640、10%滅活FBS、10 mmol/L 羥乙基哌嗪乙硫磺酸、NEAA、2 mmol/L 丙酮酸鈉、0.05 mmol/L β-巰基苯酚、2 mmol/L谷氨酰胺），體外誘導3 d，進行后續(xù)流式分選檢測敲除效率。

1.2.6 免疫細胞流式染色與分析 收集分化后的B細胞，離心去上清液，用MACS 緩沖液重懸，制備成單細胞懸液，配置細胞表面CD19 抗體、死活細胞染料與封閉抗體的混合液，每個樣本加入50 μL 染色體系，4 ℃避光反應20 min。MACS 緩沖液清洗后進行流式檢測。在表面染色之后，用細胞固定/破膜試劑盒對細胞進行固定和破膜，每個樣本加入50 μL 固定液，4 ℃反應20 min，再進行核內T-bet染色，加入T-bet 抗體室溫避光反應30 min。離心去上清液后用檢測液重懸細胞，上機進行流式檢測。用FlowJo 軟件分析結果。

1.2.7 檢測靶基因敲除效率 使用細胞抽提基因組DNA 試劑盒提取經細胞分選和病毒感染的B 細胞基因組DNA，針對sg-Tbx21靶向區(qū)域的上下游設計引物（表2），PCR 擴增待檢測DNA 片段。PCR 條件為94 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃40 s，30 個循環(huán)；72 ℃5 min。對得到的PCR 產物進行序列測通，利用ICE CRISPR 分析工具計算基因敲除效率。

表2 PCR引物序列Tab 2 Primers for PCR

1.2.8 ELISA 法檢測抗體豐度 使用小鼠免疫球蛋白面板，按說明書操作檢測IgG2c、IgG3 和IgM 3 個類別抗體的滴度。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用GraphPad Prism 8.0 軟件對數據進行分析。定量資料用±s表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 T-bet促進抗體類別轉換相關通路的上調

小鼠的體液免疫反應通常分為以Th1 細胞因子IFN-γ 為主的偏向于IgG2a/c 抗體產生的反應，以及以Th2 細胞因子IL-4 為主的偏向于IgG1 抗體產生的反應［11］。IFN-γ 下游的T-bet 是主導IgG2a/c 類別轉換的轉錄因子［12-13］。通過挖掘GEO 公共數據庫中數據集GSE84948，對IFN-γ 誘導分化的B 細胞（Be1 細胞）與IL-4 誘導分化的B 細胞（Be2 細胞）的RNA-seq 結果進行重分析，發(fā)現IFN-γ 誘導分化后，轉錄因子Tbx21基因的表達水平明顯上升，Ighm（immunoglobulin heavy constant mu）、Ighg［immunoglobulin heavy chain （gamma polypeptide） ］ 和Ighg3（immunoglobulin heavy constant gamma 3） 的水平也明顯上升（圖1A）。GSEA 結果顯示，與Be2 細胞相比，DNA 重組（DNA recombination） 和IgG 同種型轉換（isotype switching to IgG isotypes）通路在Be1 細胞中明顯上調（圖1B）。通過對GSE83697 數據集中IFN-γ 誘導分 化 的B 細 胞（Be1 細 胞） 和T-bet 敲 除B 細 胞（Be1.Tbet-ko 細胞）的測序結果進行分析，發(fā)現在Be1.Tbet-ko 細胞中，DNA 重組通路明顯下調（圖1C）。這些數據進一步表明，IFN-γ 誘導的B 細胞內表達的T-bet 是調控B 細胞抗體類別轉換的重要轉錄分子［14］。

圖1 T-bet參與調控抗體分泌細胞的抗體類別轉換Fig 1 T-bet involved in regulating antibody isotype switching in antibody secreting cells

2.2 構建高效編輯原代B 細胞基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)

為了建立用于小鼠原代B 細胞基因功能研究的高效CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，我們借鑒了前期成功構建的反轉錄病毒sgRNA 表達載體（U6-sgRNA-PGKPuro-BFP）和Cas9轉基因小鼠［8，15］，并且進一步優(yōu)化感染條件。我們分離小鼠原代B 細胞，加入R848、抗CD40 抗體和BCR 共培養(yǎng)激活24 h 后收取細胞，通過流式細胞術檢測激活后B 細胞的前向和側向散射光（FSC 和SSC），發(fā)現協(xié)同刺激后的B 細胞明顯變大（圖2A）。除此之外，感染細胞時病毒消耗量較大，因此獲得高滴度的病毒顆粒也是提高病毒感染效率的重要因素。由于工具細胞的生長狀態(tài)、目的基因大小、表達載體、轉染效率等都會影響病毒包裝效率，為了獲得穩(wěn)定的高滴度病毒顆粒，且減少直接收集的病毒上清液對后續(xù)感染細胞活性的影響，本研究對原先感染操作進行優(yōu)化：在質粒轉染細胞48 h后收取病毒上清液，高速離心后獲得病毒濃縮液，感染已激活的B 細胞。結果顯示，與未優(yōu)化組（用直接收集的病毒上清液感染未激活的B 細胞）相比，優(yōu)化組細胞活性較好，藍色熒光蛋白（BFP）陽性細胞比例可達到69.8%（圖2B）。表明原代小鼠B細胞充分激活并采用濃縮后的高滴度病毒顆粒感染可具有較高的感染效率。

圖2 編輯原代B細胞基因CRISPR/Cas9系統(tǒng)的感染條件優(yōu)化Fig 2 Optimization of infection conditions of CRISPR/Cas9 system for editing genes of primary B cells

2.3 反轉錄病毒感染B細胞后敲除T-bet的驗證

為了驗證該系統(tǒng)是否能用于B 細胞的基因敲除，對設計合成的sgRNA 進行克隆和病毒包裝。分離Cas9轉基因小鼠B 細胞，激活24 h 后，進行反轉錄病毒感染。3 d 后進行流式分選時發(fā)現，感染B 細胞（CD19+GFP+BFP+）的比例可達65.7%（圖3A）。對流式分選后的感染B 細胞抽提基因組DNA，并圍繞sg-Tbx21靶向位置上下游設計引物進行PCR 擴增后送測序。結果顯示：目的sgRNA 在T-bet 靶向序列位點上引入indel 效率為78%，T-bet 分子的敲除效率約為59%（圖3B），表明利用該系統(tǒng)可以有效地對小鼠原代B細胞進行靶基因敲除。

圖3 反轉錄病毒感染B細胞后T-bet敲除效率檢測Fig 3 T-bet knockout efficiency of T-bet in the retrovirus-infected B cells

2.4 T-bet在B細胞中參與調控IgG2c的產生

為了進一步研究T-bet 在B 細胞抗體類別轉換中的作用，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在反轉錄病毒感染后的B 細胞中加入IFN-γ 等漿細胞分化所需的細胞因子和抗體進行體外誘導分化，通過流式細胞儀檢測B細胞核內T-bet 的表達水平。結果發(fā)現，與sg-NC 組相比，sg-Tbx21組中，感染后的B 細胞中T-bet 的表達水平明顯降低（圖4A）。漿細胞分化完成后，收集細胞上清液，通過ELISA 檢測各個類別抗體豐度，結果發(fā)現T-bet被敲除后IgG2c 的水平明顯降低，IgM和IgG3 的水平未有明顯的變化（圖4B）。表明T-bet在IgG2c的產生過程中起著重要的調控作用。

圖4 B細胞中T-bet被敲除后對抗體IgG2c水平的影響Fig 4 Effect of T-bet knockout in B cells on IgG2c production

3 討論

免疫細胞中有效并且可及的基因干預手段對于研究免疫細胞的一些特征和功能具有重要意義，但是與T 細胞基因工程工具的廣泛開發(fā)不同，應用于B 細胞上的干預手段相對缺失。雖然近年來CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的基因編輯技術快速發(fā)展，得以應用于小鼠原代免疫細胞基因編輯，但仍存在很多局限性，如編輯效率、脫靶效應、同源重組效率低下等［16］。CRISPR/Cas9 基因組編輯技術依賴于sgRNA 和靶DNA 的堿基互補配對來識別靶位點［17］，未激活的原代免疫細胞處于靜息狀態(tài)，轉錄本開放程度較低，sgRNA 序列整合到基因組的能力較低，從而導致基因編輯效率較低，因此細胞充分活化是提高原代免疫細胞基因編輯效率的一個重要前提。除此之外，細胞活化后，細胞變大，與病毒顆粒接觸的表面積增加，有利于病毒遺傳物質整合到細胞基因組上，提高了Cas9 蛋白-sgRNA 復合物靶向結合到編輯位點的效率。與T 細胞類似，B 細胞激活也需要同步信號。本研究中通過BCR、CD40 和TLR 信號協(xié)同作用，可以充分動員下游磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase， MAPK） 和 核 因 子κB（nuclear factor κB，NF-κb），促進B 細胞的活化和功能［18-19］。在提高感染效率方面，我們通過濃縮病毒代替直接收集的病毒上清液，一方面是為了獲得穩(wěn)定的高滴度病毒顆粒，另一方面是因為一般病毒收集時，培養(yǎng)基的營養(yǎng)損耗較大，且含有多種代謝產物，直接培養(yǎng)感染細胞會損害細胞活性。結果顯示，優(yōu)化組無論是細胞活性還是感染效率都遠遠高于未優(yōu)化組。并以敲除T-bet為例，利用ICE CRISPR 分析工具檢測功能基因的編輯效率，并檢測感染后B細胞在漿細胞分化條件誘導下，上清液中各個抗體類型的豐度，分析結果顯示T-bet 敲除效率大大提高，并且有效抑制IgG2c型抗體的產生。

B 細胞產生的抗體發(fā)揮生物學作用既依賴Fab 端的識別，更受到類別轉換后的Fc 端類型及其下游效應細胞的影響。通過對公共數據庫中基因表達譜的分析發(fā)現，IFN-γ信號和下游的T-bet分子可促進抗體類別轉換信號通路的活化［12-13］。利用優(yōu)化的原代B 細胞病毒感染系統(tǒng)，高效地將sgRNA 導入到表達Cas9蛋白的B 細胞中，實現Tbx21基因的有效編輯；并且在編輯后的B 細胞，發(fā)現T-bet缺陷確實抑制了IgG2c抗體類型的轉換。這些結果進一步為T-bet 分子參與B 細胞抗體類別轉換的調控提供了證據。除此之外，T-bet 分子被發(fā)現在衰老/自身免疫相關B 細胞（age/autoimmune-associated B cell， ABC） 中 高 表 達，ABC 是近年來發(fā)現的在多種自身免疫疾病、感染和衰老中均有重要功能的新型B 細胞亞群，T-bet 是調控ABC 發(fā)育和功能的重要轉錄因子［20-21］。本研究所構建的Cas9 介導的原代B 細胞基因編輯手段，將有助于深入研究T-bet分子對B細胞功能的研究。

綜上，本研究使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，通過優(yōu)化感染條件，利用濃縮的高滴度反轉錄病毒感染活化增殖的小鼠原代B 細胞，高效編輯小鼠原代B 細胞中的靶基因，以T-bet 為例，驗證了敲除T-bet 能夠抑制B 細胞IgG2c 抗體類別的產生，極大地發(fā)展了原代B 細胞中的基因干預手段，未來可有效利用該系統(tǒng)研究B 細胞基因功能及抗體產生過程中的調控機制。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有動物實驗均已通過上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院實驗動物倫理委員會的審核批準（編號：2019-0103）。所有動物相關操作均按照上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院實驗動物倫理委員會的規(guī)定執(zhí)行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Institutional Animal Care and Use Committee at Renji Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine（Approval Letter No. 2019-0103）， and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of Institutional Animal Care and Use Committee at Renji Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine.

作者貢獻/Authors'Contributions

沈南、戴黛參與了實驗設計；沈南、戴黛、韓夏夏參與了論文的寫作和修改；韓夏夏、顧霜霜參與了實驗操作和數據處理。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by SHEN Nan and DAI Dai. The manuscript was drafted and revised by SHEN Nan， DAI Dai and HAN Xiaxia.The data was acquired and analyzed by HAN Xiaxia and GU Shuangshuang. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-01-24

·Accepted：2022-04-25

·Published online：2022-04-28