多組學數據解析循環及浸潤性B 細胞在結直腸癌免疫微環境中的作用

龔其雨，陳 磊

上海交通大學醫學院上海市免疫學研究所，上海 200025

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化系統常見的惡性腫瘤之一。CRC 的治療以手術根治為基礎，輔以化學治療，但仍有近半數患者受困于腫瘤的復發或轉移而無有效的治療手段。CRC 的發生是一個涉及多種癌基因多階段的突變積累的過程，同時，腫瘤所處的免疫微環境亦起著重要的調控作用［1］。免疫系統因重要的疾病防御與監測功能，近年來一直占據腫瘤治療的熱點，為CRC 的治療開辟了新的方向［2-3］。在過去10年，腫瘤免疫療法的臨床應用帶來振奮人心的成效，但也隨著腫瘤內及腫瘤間的異質性而帶來一系列問題。以免疫檢查點阻滯法（immune checkpoint blockade，ICB）治療為例，程序性死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）阻斷劑在錯配修復缺陷與高微衛星不穩定（microsatellite instability high，MSI-H）的轉移性CRC 患者中顯示出可觀療效，其呈現高水平的腫瘤突變負荷和免疫浸潤。相比之下，錯配修復和微衛星穩定的CRC 患者則對ICB治療無應答，其低水平的腫瘤突變負荷和免疫浸潤成為治療抵抗的重要原因［3-5］。因此，免疫微環境在很大程度上決定著CRC 的治療難度和患者的生存預后。長期以來，以T 細胞為主導，輔以樹突狀細胞（dendritic cell，DC）、巨噬細胞等抗原提呈的協同抗腫瘤效應長期占據免疫療法的主流研究方向［6］。然而，B 細胞這類同時兼備抗原提呈及抵御異物的多功能性細胞，在腫瘤微環境，尤其在CRC 的作用卻缺乏足夠的研究。

隨著近年的深入研究，B 細胞在腫瘤免疫微環境中的多樣化作用逐步得到人們的重視。B 細胞是多種細胞因子和趨化因子的來源，有重要的調節免疫反應作用，包括引導淋巴組織的發育，塑造和促進效應和記憶T 細胞反應［7-8］，還可通過產生LTα1β2 而獨立于淋巴組織誘導細胞驅動三級淋巴組織形成（tertiary lymphoid structure，TLS）［9-12］。此外，B 細胞可產生白細胞介素（interleukin，IL）-10 和IL-35負向調節免疫應答［7］。B細胞和漿細胞可以通過多種機制支持抗腫瘤免疫反應。近年來有研究［13-15］顯示，腫瘤組織浸潤B 細胞以及腫瘤引流淋巴結中的B 細胞（tumor infiltrating B cells，TIB）和漿細胞在機體的抗腫瘤免疫反應中具有重要作用。一項關于CRC 浸潤性B 細胞的研究［16］表明，CD20+B 細胞對CRC 的進展具有良好的預后價值，并證明CD20+B 細胞和CD8+T細胞之間具有顯著的相關性。

本研究基于單細胞轉錄組和抗體庫數據的分析，探究B細胞亞型在結直腸癌免疫微環境及腫瘤進展中的作用，比較腫瘤與癌旁浸潤性B細胞亞群組成的差異，研究潛在的分子驅動機制，分析B細胞與微環境中免疫細胞的互作關系的變化，尋找可能的調控途徑以促進B 細胞的抗腫瘤效應，以期為CRC 的腫瘤免疫治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 樣本采集并制備懸液進行單細胞測序

收集來自上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院消化科3例患者（均為Ⅰ期/Ⅱ期結直腸癌患者）的手術樣本，均無藥物治療。在告知采樣標準后，在相同環境條件下收集每位患者的腫瘤、癌旁正常組織以及外周血樣本，共9 份。新鮮組織樣本經消化后制備成單細胞懸液，經流式分選得到CD45+細胞。血液樣本經去紅處理后得到外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）。經質控后，采用10X Genomics 技術構建轉錄組和VDJ 文庫進行單細胞測序，測序數據經拼裝比對基因組后得到轉錄組和B細胞抗原受體庫（B cell receptor repertoire，BCR）數據。

1.2 構建結直腸癌浸潤及循環B 細胞亞群的轉錄組圖譜

轉錄組數據的初步分析主要使用Seurat 4.0 軟件包來完成。首先按照標準化流程處理單個樣本，包含以下步驟：質控（表達基因數小于200 和大于8 000的細胞剔除，在少于10 個細胞表達的基因剔除）、按測序深度進行測序數據標準化、log 轉化、尋找高變基因（2 000 個）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、K-means 無監督聚類分群，最后用統 一 流 形 逼 近 與 投 影 （uniform manifold approximation and projection，UMAP）實現可視化。

根據文獻［17］及實驗提供的標記基因分群，將免疫細胞分為以下幾群：①T/NK 細胞，標記基因為CD3 delta subunit of T-cell receptor complex（CD3D）、granulysin （GNLY） 和 natural killer cell granule protein 7（NKG7）。②B 細胞和漿細胞，標記基因為CD79a molecule （CD79A）、membrane spanning 4-domains A1（MS4A1）、PR/SET domain 1（PRDM1）和syndecan 1（SDC1）。③髓系細胞，標記基因為interleukin 1β （IL1B）、S100 calcium binding protein A8（S100A8）和cystatin C（CST3）。使用Harmony 3.4 軟件包去除批次效應后整合所有樣本，按上述標準化流程處理后，篩選出包含漿細胞在內的所有B細胞，根據細胞名稱匹配好BCR 數據，按標準化流程處理后重新聚類分群，依據文獻參考標記基因分亞群，計算各亞群的在各樣本的比例。同時將T/NK 細胞和髓系細胞群按照上述流程進行聚類分群，結果供細胞通信分析使用。

1.3 B 細胞各亞群在正常與腫瘤組織的差異基因和通路富集分析

使用MAST 1.20包計算B細胞各亞群在腫瘤與癌旁正常組織樣本的差異基因，選擇|log2（fold change）|（|log2（FC）|）大于2，校正后的P值小于0.001 的基因，分別挑選出上調和下調的差異基因，使用clusterProfiler 3.14 包對每個亞群進行差異基因的通路富集分析，按照校正后的P值從小到大排序，在上調和下調的通路中分別選取前10的通路進行生物分析。

1.4 基于TCGA-COAD 數據驗證B 細胞各亞群在腫瘤與正常樣本的變化

考慮到患者樣本數據量過少的原因，為了進一步驗證結果的準確性，我們應用CIBERSORTx 1.0 解卷積的方法，將B細胞各亞群的基因表達譜映射到癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的結腸癌數據（Colon adenocarcinoma，COAD）中進行分析，計算各樣本中B細胞亞群的特征基因組成得分，比較其在腫瘤和正常組織中的變化情況。同時依據患者的疾病進展信息，分析各個亞群在患者腫瘤進展中的差異變化。

1.5 B細胞亞群與免疫細胞的互作關系分析

將T/NK 細胞以及髓系細胞挑選出進行重新聚類分群后，使用cellphoneDB v3.0 細胞通信軟件計算細胞亞群間有統計學意義的分子對，選擇校正后P值小于0.05的分子對進行分析，重點關注生發中心B細胞（germinal center B cells，GCB），找出重要調控分子并分析其在免疫微環境的作用。

1.6 B細胞VDJ組庫數據分析

以患者為單位，計算B 細胞各亞群的克隆指數，并評估遷移性［18］，使用配對t檢驗比較組間統計學差異。克隆性評估指數如下：

其中，m代表在亞群C1 和C2 共有的克隆型種數；ni-C代表在亞群C 中克隆型i所含的細胞數；N代表單個樣本中每個細胞亞群的細胞總數。

1.7 B細胞抗原受體重鏈和輕鏈的突變水平分析

使用工具pRESTO v0.70 進行BCR 的突變水平分析，進行以下質控：去除引物無法識別或比對得分差的序列閱讀，保留在單樣本至少出現2 次的序列；使用國際免疫基因數據庫（ImMunoGeneTics，IMGT）作為參考；除去非功能性序列并除去超過30 個突變的序列；選擇對稱加權的核苷酸點突變數作為突變位點數。以每群B細胞的突變位點數的平均值代表該細胞群的突變水平，比較其在腫瘤和正常組織中的變化。

1.8 統計學方法

采用R 軟件包states v0.3.1 進行統計分析，定量資料包括細胞組成比例、克隆擴增指數及B 細胞重鏈突變位點數等，以±s形式表示。在腫瘤、正常和血液樣本中，細胞群組成比例的差異比較使用Kruskal-Wallis 檢驗；在TCGA-COAD 的驗證數據集中，腫瘤和正常組織的亞群組成比例差異使用獨立樣本t檢驗來分析；腫瘤和正常組織中的B 細胞克隆擴增指數的差異分析使用Kruskal-Wallis 檢驗；在B細胞重鏈突變水平的分析中，樣本間的統計學差異分析使用獨立樣本t檢驗。P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫細胞全局及B細胞亞群轉錄組圖譜

我們整合了未經治療的結直腸癌患者共9 份樣本的CD45+免疫細胞，經質量控制及批次矯正整合后分群標注，共得到35 619 個細胞，包含18 246 個T/NK細胞、14 244 個B 細胞和漿細胞及3 129 個髓系細胞（圖1A），標記基因如圖1B 所示。從細胞在3 種組織的組成比例圖可以看出（圖1C），T/NK 細胞在腫瘤樣本中普遍上升，而B細胞，尤其是漿細胞卻普遍減少，初步反映漿細胞在CRC 免疫微環境中的作用有減弱趨勢。接下來將所有B 細胞及漿細胞分選出來，并結合8 804 個BCR 陽性細胞輔助分選（圖1D），進行后續分析。

圖1 免疫細胞全局轉錄組圖譜Fig 1 Transcriptome map of main immune cells

我們對14 244 個B 細胞按標準化流程處理后重新聚類分群，得到如下13 個細胞亞群：GCB、濾泡B 淋巴細胞（follicular B cell，FoB）、未轉化的記憶B 細胞（non-switched memory B cell，nsMemB）、轉化 的 記 憶 B 細 胞 （switched memory B cell，sMemB）、 高表達熱休克蛋白的記憶B 細胞（sMemB-HSP）、高表達免疫球蛋白IgA 的記憶B 細胞（sMemB-IgA）、調節性B 細胞（regulatory B cell，Breg）、漿母細胞（plasmablast，PB），以及表達各類免疫球蛋白亞型的漿細胞（plasma cell，PC），如PC-IGHM、PC-IGHA1、PC-IGHA2、PCIGHA1/2、PC-IGHG1 等。標記基因如圖2A、2B 所示。B 細胞各亞群在3 種組織樣本中展現出不同的浸潤模式（圖2C）。相較于正常組織，腫瘤樣本中有較多的CD20+B 細胞浸潤， 表現在GCB、nsMemB、sMemB 和sMemB-HSP 顯著上升（P值分別為0.023、0.002、0.002、0.031），而漿細胞主要以表達IGHM 和IGHA 類（包含PC-IGHA1 和PCIGHA2 這2 類）免疫球蛋白的漿細胞比例顯著下降（P值分別為0.021、0.000）。結果表明CD20+B 細胞在腫瘤微環境中作用顯著提升，相反，漿細胞（尤其是表達免疫球蛋白IgA 類型的）呈顯著下降趨勢，表明漿細胞在微環境中的作用大幅削弱。此外，外周血樣本的組成中以記憶B 細胞為主，尤其是未經轉化的B 細胞，表明記憶B 細胞是循環性B 細胞發揮抗腫瘤效應的主力軍。

圖2 B細胞亞群轉錄組圖譜Fig 2 Atlas of B cell subclusters in CRC

2.2 基于TCGA-COAD 數據驗證B 細胞各亞群在腫瘤與正常組織的差異

我們將B 細胞亞群的單細胞表達圖譜映射到TCGA 的COAD 數據中，計算B 細胞亞群的組成得分。如圖3A 所示，GCB 在腫瘤顯著上升，轉化后的記憶B 細胞均顯著上升，這與單細胞的分析結果一致。同時，表達IGHA1/2 和IGHG1 類漿細胞顯著下降，進一步印證了漿細胞在微環境中作用受到限制。有背景研究報道，IGHG1 類漿細胞是微環境中腫瘤特異性抗體的主要分泌細胞，且可通過NK 細胞的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）及誘導巨噬細胞的吞噬作用來行使抗腫瘤作用。由此推測，漿細胞的抗腫瘤作用受到抑制。GCB 是免疫微環境中記憶B 細胞和漿細胞的生成來源，我們考慮GCB在腫瘤免疫微環境中的發育狀態是否有所改變，接下來對GCB在微環境中的變化進行重點關注。

考慮到我們的樣本均來自早期CRC患者，于是我們結合TCGA患者的病程信息來分析GCB的變化。如圖3B所示，隨著疾病惡化，在Ⅰ～Ⅲ期，GCB得分逐漸下降，且差異均具有統計學意義（P值分別為0.003、0.024），提示腫瘤的發展過程中GCB的功能逐步被抑制。在Ⅳ期，雖然GCB特征呈上升趨勢，但無統計學意義。

為進一步探究GCB 在腫瘤微環境的驅動下發生了何種變化，我們對腫瘤樣本中GCB 的差異基因做了通路富集分析。結果如圖3C 所示，GCB 在腫瘤中的抗原提呈功能顯著上升，有利地支持了T細胞的激活和增殖，同時自身也在進行有效的VDJ 重排以提高特定抗原親和力的趨勢，具有積極的抗腫瘤效應。而在下調通路中，我們也發現與分泌抗體相關的通路顯著下調，這提示我們漿細胞減少的一大原因是否由GCB轉化的趨勢減少所致。

圖3 TCGA-COAD數據分析B細胞亞群在腫瘤與正常組織的組成差異Fig 3 Composition of B cell subsets in tumor and normal tissues by TCGA-COAD data profiling

2.3 GCB與T細胞和髓系細胞的通信分子對

在上述的研究中，我們發現GCB 可能在CRC 的免疫微環境中發揮著積極的作用。為探究外部環境的影響因素，我們進行了細胞通信分析。圖4A 所示，為T 細胞與GCB 關系網絡中具有統計學意義的通信分子對。可以看出在腫瘤樣本中，具有抑制T細胞功能的分子對顯著下降，如CD160-TNFRSF14、LTATNFRSF1B、CCL4-CNR2，這對于促進T細胞的殺傷腫瘤作用是有積極意義的［19］。此外，在腫瘤中上升的信號還包括促進T 細胞和B 細胞激活與發育的分子對，如CD27-CD70、CXCL13-CXCR5［20-21］。然而，也存在一些微弱的抑制性信號在腫瘤中增強，如LGALS9-CD44，根據文獻報道具有促進并穩定調節性T 細胞（regulatory T cell，Treg）發育的作用，以及CD52-SIGLEC10 抑制T 細胞的功能［22］。這提示我們GCB 在生發中心的功能是多面的，但以促進和激活T 細胞的抗腫瘤作用為主。或許針對GCB 采取措施，特異性激活并提高T細胞功能的信號，抑制其與Treg或耗竭T 細胞的聯系，可以有效促進免疫微環境整體的抗腫瘤作用。而在髓系細胞，B 細胞亞群與之通信的情況在腫瘤和正常組織中變化較小。值得關注的是腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體家族信號在腫瘤中上調，表明GCB 細胞在微環境中有微弱促進巨噬細胞功能的作用（圖4B）。總之，B細胞在CRC免疫微環境中展示的總體作用是促進抗腫瘤效應的信號。

圖4 B細胞亞群與T細胞亞群及髓系細胞亞群的通信分子對Fig 4 Interecting pairs between B cell subsets with T cells and myeloid cells

2.4 B細胞各亞群的抗原受體庫分析

圖5A所示，為B細胞各亞群在3種組織樣本的克隆擴增情況。總體比較，B 細胞在正常與腫瘤組織中的克隆指數較PBMC較低，而腫瘤樣本與正常組織相比，大部分B 細胞亞群的克隆指數均較低，但GCB與PB 這2 個亞群在腫瘤中均上升，且差異具有統計學意義（均P=0.000），提示它們可能在免疫微環境中受到抗原刺激后積極增殖（圖5B、5C）。這對于B細胞的抗腫瘤效應是積極有利的。同時GCB 的B 細胞受體重鏈在腫瘤中的突變頻率也高于正常組織，且差異具有統計學意義（P=0.000），這提示GCB 突變水平在提高，進而有力地提升與腫瘤抗原的親和力。

圖5 B細胞各亞群的克隆擴增情況及GCB在組織的突變水平比較Fig 5 Clonal expansion index of B cell subsets and mutation level of GCB

各亞群間的遷移指數如圖6，顯示出與轉錄組一致的分析結果。在正常組織中，CD20+各亞群間的轉化指數均較低，GCB 也主要與漿母細胞共享較多的克隆型。而在腫瘤中，GCB與表達IgA類免疫球蛋白的記憶B 細胞有較多的共享克隆型，再次證明GCB在腫瘤中更朝向記憶B細胞發展。

圖6 B細胞各亞群在正常(A)、腫瘤(B)和外周血(C)組織中的克隆型遷移指數比較Fig 6 Transition index of B cell subsets among normal(A),tunor(B)and PBCM(C)sample

3 討論

本研究通過生物信息學分析的方法，基于單細胞轉錄組及免疫組庫數據，對結直腸癌浸潤和循環性B細胞進行了詳細分析，發現CD20+B 細胞在腫瘤組織中顯著上升，以GCB 作用最顯著；以通路分析、通信分析以及VDJ 組庫數據分析闡釋了GCB 的積極作用，發現它在微環境中具有積極的抗腫瘤效應，一方面對T細胞的抗腫瘤效應起到了有力的支持作用，另一方面腫瘤組織中的GCB 自身也在進行高水平的BCR 重鏈突變，以適應腫瘤抗原進行高親和力的演變。與之相反的是漿細胞在腫瘤中的作用大幅減少，以表達IgA 類的漿細胞為主，同時GCB 向漿細胞的演化發展在腫瘤組織中逐漸降低，取而代之的是逐步向記憶B 細胞方向的發展。總之，B 細胞在結直腸癌的腫瘤免疫微環境中亦發揮重要作用，它不是簡單的旁觀者細胞，而是從根本上協調免疫反應的積極參與者。

通過從B 細胞亞群在3 種組織中不同浸潤模式研究中確定的CD20+B 重要性， 表現為GCB、nsMemB、sMemB 和sMemB-HSP 的顯著上升，同時表達IGHM 和IGHA 類免疫球蛋白的漿細胞顯著下降。這提示我們思考B 細胞在腫瘤微環境中發生轉變的原因，我們選擇記憶B 細胞和漿細胞兩者共同的來源——GCB 進行探究。通過將單細胞數據的轉錄圖譜映射到TCGA-COAD 的數據中，我們發現GCB 在腫瘤組織中亦是顯著上升的，并且隨著腫瘤的進展，GCB 的組成比例逐漸下降，我們猜測可能是由于GCB 在腫瘤發展中功能受到了抑制。經由通路富集分析，我們發現GCB 在腫瘤中的抗原提呈功能顯著上升，有利地支持了T 細胞的激活和增殖，同時自身也在進行有效的VDJ 重排以提高特定抗原親和力的趨勢，具有積極的抗腫瘤效應。而在下調通路中，我們也發現與分泌抗體相關的通路顯著下調，這提示我們漿細胞減少的一大原因或許是由GCB 轉化的趨勢減少所致。為了進一步探究微環境對GCB 細胞自身功能的影響，我們通過細胞互作分子對分析發現，具有抑制T 細胞功能的分子對顯著下降，同時促進T 細胞和B 細胞激活與發育的分子對也顯著上調，展示了GCB 細胞在CRC 免疫微環境中對T 細胞抗腫瘤作用的積極支持。在GCB 與髓系細胞的通信分析中，TNF 的信號增強提示GCB 細胞對于巨噬細胞發揮抗腫瘤效應的潛在支持作用。綜合來看，我們認為在早期的腫瘤微環境中，GCB 細胞通過間接的正向支持作用從而發揮積極的抗腫瘤效應。最后，我們通過VDJ 組庫數據探討上述分析結果，從克隆指數和遷移指數兩方面評估，發現GCB在腫瘤組織中顯著克隆擴增，同時發生高水平的重鏈突變，這反映了GCB 擴增并提高腫瘤抗原親和力的趨勢。從亞群間的遷移分析，我們發現GCB 在腫瘤組織中更朝向記憶B 細胞的方向發展。然而，究竟記憶B 細胞在結直腸癌的腫瘤免疫微環境中發揮了什么樣的作用，在未來的工作中，仍需要進行進一步的探索分析。

綜上，對結直腸癌免疫微環境中的B細胞有了初步探索。CD20+B 細胞在腫瘤組織中顯著上升，以GCB 作用最顯著，通過自身體細胞高頻突變以及和周圍免疫細胞的聯系，發揮積極的抗腫瘤效應。提升GCB 細胞的功能或許是未來免疫治療的一大方向，可為提升腫瘤的治療效果提供新思路。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻/Authors'Contributions

龔其雨、陳磊參與了實驗設計；龔其雨、陳磊參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by GONG Qiyu and CHEN Lei.The manuscript was drafted and revised by GONG Qiyu and CHEN Lei.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2021-11-18

·Accepted：2022-03-28

·Published online：2022-04-28