兩種方法檢測結核分枝桿菌利福平耐藥性比較

姚銀釵，梁啟德，蔣敏

廣州市胸科醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510095

結核病是感染結核分枝桿菌導致的一類慢性傳染病，而肺結核屬于結核病中一種最常見類型，主要癥狀是呼吸系統(tǒng)功能異常[1]。 近些年來，耐藥結核病的患病率不斷升高，尤其是廣泛耐藥結核病（XDRTB)發(fā)病率日益增加，有臨床治愈率較低及病死率較高等特點，使結核病控制難度進一步提升。 因此，結核病、 耐藥結核實驗室檢查及診斷對防治結核病有重要意義。 與培養(yǎng)法等傳統(tǒng)檢測方式相比，Gene Xpert MTB 有檢測速度快、 靈敏度高和特異度高等優(yōu)點，能協(xié)助臨床更好地選取合理治療方案，同時避免耐藥菌株傳播，被推薦為耐藥結核篩查首選方式[2]，而PCR 熔解曲線屬于近年來出現(xiàn)的一類新型耐藥結核分子檢測技術[3]。 當前，有關二者對耐藥結核的檢測對比研究較少。 為此， 該文選取2020 年8—12 月該院就診的151 例肺結核患者為研究對象， 就PCR 熔解曲線與Gene Xpert MTB 兩種方法在結核分枝桿菌利福平耐藥性檢測中的效果開展對比分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集該院肺結核患者151 例的痰液標本， 其中男97 例，女54 例；年齡13～87 歲，平均（49.25±8.76）歲；同時收集該院其他呼吸道疾病患者（明確診斷非肺結核患者， 未排除陳舊肺結核患者）20 例的痰液標本，其中男12 例，女8 例；年齡28～96 歲，平均（50.06±7.84）歲。兩組患者一般資料對比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。 納入標準：①肺結核患者依據(jù)《臨床診療指南》（結核病分冊）[4]中有關診斷標準確診； ②認知能力正常， 可配合完成此次研究。 排除標準：①存在認知障礙或者嚴重神經(jīng)、精神疾病者；②拒絕或者中途退出此次研究者；③無完整臨床資料者。

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑 Gene Xpert MTB 檢測系統(tǒng)和試劑盒為美國Cepheid 公司生產；全自動SLAN-96 醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)由上海宏石醫(yī)療科技有限公司生產；Lab-Aid824 核酸提取儀由廈門百維信生物科技有限公司生產；結核分枝桿菌利福平耐藥基因突變檢測試劑盒購自廈門致善生物科技有限公司； 磁珠法核酸提取試劑由廈門致善生物科技有限公司生產。

1.2.2 檢測方法 （1）Gene Xpert MTB：將患者的痰液標本加入到2 倍體積液化工作液中， 進行30 s 的振蕩混勻，后于室溫內放置15 min，等樣本全部液化之后， 采取無菌吸管將其中2 mL 取出后加入至Cartridge 反應盒中，后經(jīng)Gene Xpert MTB 檢測系統(tǒng)開展檢測，嚴格依據(jù)說明書中內容開展操作，等到2 h左右后儀器能自動得出檢測結果。

（2）PCR 熔解曲線：①結核分枝桿菌有關復合體迅速檢測：將患者的痰液標本加入到2 倍體積工作液內，進行長達30 s 振蕩混勻，后在室溫中放置15 min，等到全部液化之后，選擇1.5 mL 的樣本轉移到已經(jīng)標記過的2.0 mL 管內， 通過13 000 r/min 速度開展5 min 離心處理， 將上清液棄去； 后加入300 μl 的TB-DNA 裂解液到含沉淀離心管內， 進行充分振蕩混勻，以99°C 溫度進行10 min 加熱，后依據(jù)自動核酸提取試劑盒中說明書內容進行結核分枝桿菌的DNA 提取。 ②結核分枝桿菌有關耐藥突變檢測：依據(jù)PCR 熔解曲線結核分枝桿菌有關檢測耐藥突變試劑盒中說明書開展操作， 具體如下： 選取樣本量（n）×19.6 μl 利福平PCR MIX A 與n×0.4 μl TB 酶混合溶液加入至1.5 mL 的離心管內，進行充分振蕩混勻，后進行瞬時離心處理；另外選取n×19.6 μl 利福平PCR Mix B 與n×0.4 μl TB 酶混合溶液加進1.5 mL 的離心管內，進行充分振蕩混勻，瞬時離心處理，同時以每管20 μl 依次分裝在實時PCR 儀附帶PCR反應管內，經(jīng)微量加液器往每支分裝好PCR 反應管內依次加進提取樣品與陰性和陽性對照各有5 μl，蓋嚴管蓋。 充分混勻后瞬時離心，后轉移PCR 反應管到PCR 擴增區(qū)，放到SLAN-96 PCR 儀器內。 PCR的熔解反應程序和上述相同，保存后運行。

1.3 觀察指標

分析PCR 熔解曲線與Gene Xpert MTB 在檢測結核分枝桿菌中的符合率， 同時將BD 快速藥敏作為金標準， 統(tǒng)計兩種檢測方式對結核分枝桿菌利福平耐藥性的檢測準確度、敏感度及特異度情況。準確度=（真陽性+真陰性）/總數(shù)×100.00%； 特異性=真陰性/（真陰性+假陽性）×100.00%、靈敏性=真陽性/（真陽性+假陰性）×100.00%[5]。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件分析處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采用頻數(shù)和百分比(%)表示，采取χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 151 例肺結核患者兩種檢測方式的結核分枝桿菌檢測結果

151 例肺結核患者經(jīng)Gene Xpert MTB 法顯示結核分枝桿菌陽性140 例， 陽性率92.72%（140/151）；PCR 熔解曲線法顯示陽性141 例， 陽性率93.38%（141/151）。 經(jīng)兩種方法檢測結果均呈陽性共138例，均呈陰性共8 例，符合率96.69%（146/151）。 20例其他呼吸道病患者中2 例經(jīng)Gene Xpert MTB 法檢測顯示為陰性， 經(jīng)PCR 熔解曲線法顯示為陽性，見表1、表2。

表1 151 例肺結核患者兩種檢測方式的結核分枝桿菌檢測結果

表2 20 例其他呼吸道病患者兩種檢測方式的結核分枝桿菌檢測結果

2.2 兩種方式結核分枝桿菌均為陽性的138 例患者痰液標本內利福平耐藥狀況分析

經(jīng)BD 快速藥敏檢出利福平耐藥陽性22 例，陰性116 例；經(jīng)PCR 熔解曲線法檢測利福平耐藥陽性21 例，陰性117 例；經(jīng)Gene Xpert MTB 法檢出利福平耐藥陽性20 例，陰性118 例，見表3、表4。

表3 PCR 熔解曲線法檢測利福平耐藥的結果分析

表4 Gene Xpert MTB 法檢測利福平耐藥的結果分析

2.3 兩種檢測方式對利福平耐藥的檢測效能對比

PCR 熔解曲線法、Gene Xpert MTB 法對利福平耐藥的檢測準確度、 敏感度及特異度比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表5。

表5 兩種檢測方式對利福平耐藥的檢測效能對比（%）

3 討論

耐藥性肺結核特別是廣泛耐藥肺結核、 耐多藥肺結核屬于結核病防治工作中的主要障礙。 有調查顯示，于國內有近5.7%的新發(fā)肺結核患者及25.6%的治療后肺結核患者伴隨耐多藥現(xiàn)象[6]。 正確、迅速結核分枝桿菌有關藥敏檢測技術屬于早期觀察到耐藥患者的重要保證， 能為后續(xù)臨床治療工作開展起到重要的指導作用，提升耐藥患者的治愈率，避免耐藥結核流行。

痰培養(yǎng)和藥敏試驗雖是當前結核病、 耐藥結核病的診斷金標準， 但受陽性檢出率較低和實驗周期較長等因素影響，無法及時給臨床診療提供信息，進而會影響到結核病診療效果和耐藥結核病防治[7]。近年來，伴隨各類分子生物學有關技術進步，結核分枝桿菌有關耐藥基因檢測新型方法逐漸被普及到臨床。 Gene Xpert MTB 屬于美國Cepheid 公司所研發(fā)的一類能迅速檢測結核分枝桿菌和利福平耐藥性的手段，可彌補以往檢測方式耗時過長等缺陷，其將巢式PCR 和熒光PCR 相結合， 將利福平耐藥有關rpoB 基因當作靶基因， 結合rpoB 耐藥決定其81bp范圍中序列對5 對探針開展設計， 并對不同熒光基團開展標記，后MTB 野生株可于5 個探針相對應的位置擴增得到S 型曲線， 而突變株經(jīng)擴增無法得到1 條或多條曲線， 因此能于2 h 內對MTB 及RIF 耐藥一同開展檢測[8-10]。 巢式PCR 應用能提升敏感性2～3 個數(shù)量級，對于原始產物分析能得到一致性、高質量產物累積，使得非特異擴增減少[11]。PCR 熔解曲線法屬于近年來新出現(xiàn)的一類分子診斷技術， 能經(jīng)識別出結核分枝桿菌的特異基因rpoB 基因、eis 基因 啟 動 子 區(qū)、KatG315 和inhA94 密 碼 子、ahpC 和inhA 啟動子區(qū)、rrs 基因和gyr4 基因的突變位點以獲取利福平等抗結核藥耐藥信息[12-14]。

賴惠英等[15]比較Gene Xpert MTB、PCR 熔解曲線在檢測利福平耐藥中的效果，最終發(fā)現(xiàn)，兩種檢測方法的準確度、敏感度及特異度相當，其中，PCR 熔解曲線法對利福平耐藥的檢測準確度、敏感度及特異度是97.90%、93.85、97.90%，與Gene Xpert MTB 法的準確度、敏感度及特異度96.90%、93.80%。 100.00%比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 該次研究發(fā)現(xiàn)，PCR 熔解曲線法對利福平耐藥的檢測準確度、 敏感度及特異度是99.28%、95.45%、100.00%與Gene Xpert MTB 法的98.55%、90.91%、100.00%差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），這和賴惠英等研究結果一致，說明兩種方式在利福平耐藥檢測中均有重要價值。 但存在差異的是該研究未對福喹諾酮、 異煙肼和二線類注射藥的藥敏結果開展分析， 還需在未來研究中進一步完善。

綜上所述，Gene Xpert MTB、PCR 熔解曲線法均能安全、準確、迅速應用到結核病和結核分支桿菌的利福平耐藥檢測中，對早期發(fā)現(xiàn)、診斷和治療耐藥結核病有重要意義。