基于網絡藥理學探討瓜蔞薤白半夏湯治療COPD的作用機制

蔣先偉 馬戰平

(1陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046；2名中醫馬戰平傳承工作室；3陜西省中醫醫院)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種臨床常見的持續性、進行性的慢性氣道炎癥性疾病〔1〕，其主要特征為持續存在的呼吸系統癥狀及不可逆氣流受限,其發病多與吸煙、環境污染、化學物質、職業粉塵等因素密切相關〔2〕。近年來，COPD已成為全球最嚴重的呼吸系統疾病之一，其新增確診率和致死率不斷攀升〔3〕，其反復發作的特性是導致COPD患者死亡率居高不下的關鍵，所以提高對COPD危險因素的控制及減少其急性發作次數成為現在臨床中亟待解決的問題。而中醫藥在防治COPD上有一定優勢，能夠減少急性加重次數，改善患者癥狀及肺通氣功能，提升患者生活質量〔4,5〕。

現代研究表明瓜蔞薤白半夏湯在COPD治療上亦有其獨特優勢，如黃楚燕等〔6〕自擬加味瓜蔞薤白半夏湯能顯著提高臨床療效,降低炎癥表達,改善患者肺通氣功能和凝血功能；張炳填等〔7〕發現瓜蔞薤白半夏湯可抑制COPD模型大鼠血清中白細胞介素(IL)-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達，減輕炎癥反應，從而起到對COPD較好的治療作用。

網絡藥理學可以科學地闡釋中藥及中藥復方治療疾病的分子機制，從而成為中醫藥治療疾病多成分、多靶點、多通路的直接證據〔8〕。利用網絡藥理學有利于推進中醫藥現代化的步伐，為中藥復方的臨床及實驗研究提供依據并指明發展方向。故本文基于網絡藥理學及分子對接技術，探討瓜蔞薤白半夏湯治療COPD的作用機制，為后續研究提供相關依據。

1 材料及方法

1.1瓜蔞薤白半夏湯主要化合物篩選及治療靶點的獲取 將瓜蔞、薤白、半夏三味藥物輸入中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)中進行檢索，設置口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18為篩選條件，獲取到符合條件的化合物；并通過平臺獲取化合物對應的相關靶點，以待后續進行比對。同時利用 Uniprot 數據庫，對所有靶點進行標準化處理。

1.2COPD疾病靶點的獲取 將“chronic obstructive pulmonary diseases”作為搜索關鍵詞，分別在人類基因數據庫(GeneCards，https://www.genecards.org/)、藥物銀行(DrugBank，https://go.drugbank.com/)及人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM，https://omim.org/)數據庫進行檢索，獲得COPD疾病相關靶點，并進行比對整合去除重復。

1.3交集靶點的獲取 將所獲取的中藥潛在治療靶點及疾病靶點進行整合篩選后，利用R語言軟件進行交集的獲取并繪制韋恩圖。

1.4藥物-成分-靶點網絡關系圖的繪制 將獲得的瓜蔞薤白半夏湯的主要化合物與獲得的交集基因導入Cytoscape軟件中進行藥物-成分-靶點網絡關系圖的繪制。網絡圖中node1代表藥物，node2代表靶點，edge代表不同節點間的相互關系，并根據網絡度值(Degree)的大小進行分類，Degree越大，說明其在網絡中作用越重要。根據其Degree篩選出網絡中排名前十的關鍵化合物，以備后續分子對接驗證。

1.5蛋白互作(PPI)網絡的繪制及核心靶點的篩選 再將獲得的交集基因導入到蛋白質相互作用數據庫(STRING，https://string-db.org/)網絡平臺中，并設置最低作用閾值(>0.9)，去除游離基因，構建PPI；然后將網絡導入到Cytoscape軟件中利用CytoNCA插件進行核心網絡的篩選。

1.6基因本體論(GO)生物學富集分析及京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 利用R語言軟件進行KEGG代謝通路富集分析、GO富集分析，設置P<0.05及矯正后的P<0.05為篩選條件進行分析，輸出結果并繪制相應柱狀圖，圖中縱坐標為生物過程或通路名稱，橫坐標代表富集在其中的基因數量，而顏色代表富集的顯著性，顏色越深，代表基因在該生物過程或通路中富集顯著性越強。

1.7分子對接虛擬驗證 從PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中獲取“藥物-成分-靶點”網絡關系圖中篩選出的度值較高化合物的小分子2D結構，將其導入Chemm Office 軟件轉換為3D結構，并按最小的自由能進行結構優化；利用PDB 蛋白質結構數據庫(RCSB，http://www.rcsb.org/)平臺PPI網絡獲取到的核心蛋白受體結構，并利用Pymol 軟件去除水分子及小分子配體，然后導入 AutoDockTools 軟件進行加氫等預處理；最后利用Vina軟件進行分子對接，驗證其結合活性。

2 結 果

2.1瓜蔞薤白半夏湯主要化合物及治療靶點 在TCMSP平臺中按照OB≥30%，DL≥0.18為條件篩選后共獲得主要化合物35種，其中瓜蔞11個，薤白11個，半夏13個；然后將所獲得的化合物與治療靶點進行比對，獲得成分靶點68個。

2.2COPD疾病靶點的獲取 在GeneCards、DrugBank及OMIM中以“chronic obstructive pulmonary diseases”為關鍵詞進行檢索。其中GeneCards中將Score>1作為篩選條件，獲得2 421個疾病靶點，DrugBank數據庫獲得206個疾病靶點，OMIM數據庫獲得349個；將3個數據庫獲得靶點進行整合，去除重復后共獲得2 505個疾病靶點。

2.3交集靶點的獲取 將前兩項中所獲得靶點進行整合篩選后，利用R語言軟件進行交集靶點的獲取，共獲得交集靶點139個。

2.4藥物-成分-靶點調控網絡圖 將上述獲得的主要化合物與交集基因共同導入Cytoscape軟件中，繪制出“藥物-成分-靶點”調控網絡圖(圖1)，并將藥物成分按照Degree大小進行篩選后，獲取到網絡中起到主要作用的化合物(表1)，以備后續進行分子對接驗證。

圓形代表藥物，方形代表靶點，顏色中紅色代表半夏，紫色代表薤白，橙色代表瓜蔞圖1 “藥物-成分-靶點”調控網絡

表1 主要化合物Degree及來源

2.5PPI及核心靶點 將所獲得的交集基因導入STRING網絡平臺中構建PPI(圖2)，其中節點代表基因，連線代表蛋白互作關系，不同顏色代表不同證據。然后將網絡導入到Cytoscape軟件中利用CytoNCA插件進行計算網絡節點的度中心性(DC)、介度中心性(BC)、接近中心性(CC)、特征向量中心性(EC)、網絡中心性(NC)和局部邊連通性(LAC)，得到上述值的中位數，小于中位數的靶點則去除。經過拓撲分析后，得出核心基因(圖3)。提取核心網絡中度值較高的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)3、JUN、MAPK1、TP53、FOS、雌激素受體α(ESR1)作為分子對接中的蛋白受體。

圖2 PPI

圖3 PPI核心網絡

2.6GO生物學富集結果及KEGG通路富集結果 GO生物學富集分析結果(圖4)顯示共獲得2 397條結果，其中生物過程(BP)2 112條，主要涉及細胞對藥物的反應、細胞對氧化應激的反應、對金屬離子的響應、對抗生素的反應、對活性氧的反應、對脂多糖的反應、對營養水平的反應、氧化應激反應和對細菌源分子的反應等；細胞組分(CC)87條，主要涉及細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物、突觸后膜的內在成分、突觸后膜的組成部分、突觸前膜固有成分、質膜筏、突觸前膜的組成部分、膜區、膜微區等；分子功能(MF)198條，主要涉及抗氧化活性、類固醇激素受體、泛素蛋白連接酶結合、氧化還原酶活性、配體激活的轉錄因子活性、核受體活性、泛素樣蛋白連接酶結合、磷酸酶結合等。

圖4 GO生物學富集分析

KEGG富集分析結果(圖5)共獲得通路167條，主要涉及流體剪切應力與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、TNF通路、糖尿病并發癥中的晚期糖基化終末產物-糖基化終末產物受體(AGE-RAGE)信號通路、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-Akt信號通路小細胞肺癌、甲型流感、低氧誘導因子(HIF)-1信號通路、人巨細胞病毒感染、膀胱癌、前列腺癌等，提示瓜蔞薤白半夏湯可能通過上述通路起到對COPD的干預作用。

圖5 KEGG通路富集分析

2.7分子對接結果 將獲得的重要化合物槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素、黃芩素、豆甾醇、羥基芫花素分別與獲得的核心靶點：MAPK3、JUN、MAPK1、FOS、TP53、ESR1進行分子對接，其結果見表2；文獻報道稱，一般結合能分值≤-5.0 kCal/mol，則表示具有較好結合作用〔9〕；結果表明槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素、黃芩素、豆甾醇、羥基芫花素與核心基因MAPK3、JUN、MAPK1、FOS、TP53、ESR1結合能均小于-5.0 kCal/mol，提示其具有良好的結合能力(圖6)。

表2 活性化合物與核心靶點結合能

圖6 藥物的主要活性成分與蛋白的分子對接

3 討 論

3.1中醫對COPD的認識 COPD屬于中醫“肺脹、喘證”范疇，其臨床主要表現為咳嗽、咯痰、氣短、氣喘、胸悶等癥狀。其主要病機則責之于虛、痰、瘀，病情日久，氣耗則虛，正氣虧虛，則機體氣化不足，促使陰邪痰飲生成，痰飲留駐，虛實轉換，更礙氣機流行，則瘀血隨之而生，終成虛、痰、瘀三者互相夾雜，虛實錯雜之勢。而痰作為其最重要的病理因素，伴隨病程始終；瓜蔞薤白半夏湯作為治療痰濁內阻的胸痹主方，其通陽散結、豁痰開胸之功用與肺脹病機不謀而合，且早在20世紀90年代，就有醫家〔10〕論述COPD與胸痹的關系，認為肺脹病程中氣虛、痰飲、瘀血阻于胸間亦與胸痹“陽微陰弦”的特點相符，為瓜蔞薤白半夏湯治療肺脹提供了理論支撐。現代研究表明，瓜蔞中的氨基酸有顯著祛痰功效，所含天冬氨酸也可以抑制炎癥反應，從而使呼吸道分泌物減少〔11〕；薤白具有良好的解痙平喘作用,其同時具有良好的抗菌、抗氧化作用〔12～14〕；對半夏的研究表明，其具有良好的鎮咳祛痰、抗菌、抗氧化抗炎作用〔15～18〕。

3.2主要化合物分析 通過對藥物-成分-疾病-靶點網絡圖的分析得知，槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素、黃芩素、豆甾醇、羥基芫花素可能是瓜蔞薤白半夏湯治療COPD的關鍵化合物。現代研究表明，COPD的發病機制與炎癥、氧化應激、黏液高分泌、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、氣道重塑等密切相關〔19〕。而槲皮素具有明顯的抗菌、抗炎、抗氧化作用〔20～22〕，如魏萍等〔23〕研究發現，槲皮素可以有效改善COPD模型大鼠肺損傷情況，提高其肺功能水平，抑制炎癥因子表達和細胞凋亡，同時能抑制轉化生長因子(TGF)-β1信號通路，改善其氣道重塑情況；柚皮素也具有明顯的抗菌、抗炎、抗氧化、止咳祛痰功效〔24〕,如江勇等〔25〕研究發現柚皮素可抑制肺泡巨噬細胞內NLRP3炎癥小體的活化，從而減輕膿毒癥大鼠急性肺損傷；同時β-谷甾醇、黃芩素、豆甾醇、羥基芫花素亦有較好的抗炎、抗菌、抗氧化作用〔26～29〕。以上結果表明，瓜蔞薤白半夏湯治療COPD是多種化合物共同作用所取得的結果，表現出中藥復方多成分的特性。

3.3PPI核心網絡分析 通過拓撲分析后，提取出較為重要的6個靶點為MAPK3、JUN、MAPK1、TP53、FOS、ESR1。其中MAPK3、MAPK1同屬于絲裂酶原活化蛋白激酶，參與細胞的分化、凋亡、增殖等過程〔30〕，有研究表明，MAPK信號通路在COPD炎癥反應、黏液高分泌、氣道重塑等方面發揮重要作用，是COPD治療的重要靶點〔31,32〕，如p38 MAPK可以激活TGF-β從而達到對肺部炎癥和纖維化的影響〔33,34〕。轉錄因子AP-1是由JUN、FOS和ATF亞基的二聚轉錄因子共同組成的，而JUN和FOS的轉錄直接關系到AP-1的活性〔35，36〕，而MAPK信號通路是激活AP-1的重要途徑，其ERK、JNK、p38都可以通過JUN和FOS激活AP-1〔37〕,AP-1的激活則與肺組織在煙霧或環境因素影響下的氧化應激反應呈正相關〔38〕。TP53是一種腫瘤抑制因子，可通過調節細胞周期從而達到抑制炎癥作用〔39〕，有研究發現，肺泡Ⅱ型上皮細胞被卡介苗結核分枝桿菌(BCG)感染時，P53可通過抑制TNF-α介導細胞死亡〔40〕。ESR1是雌激素受體，在不同類型的肺內均有表達，有研究表明，選用雌激素作為干預措施，可有效抑制NF-κB的轉錄與表達，降低內皮黏附因子表達，降低炎癥因子表達，從而達到治療COPD的效果〔41〕。由此推測，瓜蔞薤白半夏湯可能是通過上述靶點干預COPD，但尚需后期實驗進行驗證。

3.4GO生物學富集結果及KEGG通路富集結果分析 GO生物學富集結果主要集中在細胞對氧化應激的反應、對抗生素的反應、對活性氧的反應、對營養水平的反應、對脂多糖的反應等。其中氧化應激反應是COPD發病和發展的重要環節，研究表明，其不僅可直接導致肺部損傷，同時能夠激活肺內多種炎癥因子表達，促進肺內抗蛋白酶氧化失衡，增加黏液分泌〔42〕。

營養水平的下降也是COPD患者病情不斷加重的重要因素，謝梅等〔43〕將576例老年COPD患者分為營養正常312例，有營養不良風險192例，營養不良72例進行觀察，其結果表明營養正常組肺功能明顯高于其他兩組。由上可知，這些生物學過程貫穿治療COPD的全過程，并能與通路富集結果相互驗證。

KEGG通路富集結果主要集中在AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、IL-17信號通路、TNF通路、HIF-1信號通路等。結合COPD主要發病機制，筆者推測瓜蔞薤白半夏湯通過以下方面發揮治療作用：(1)抗炎，研究表明PI3K-Akt信號通路、IL-17信號通路、TNF通路作為經典的炎癥信號通路，與COPD密切相關。研究表明PI3K參與炎癥細胞的募集和活化，并能夠激活其下游的NF-κB進行轉錄，增強炎癥的表達〔44〕；同時AGE-RAGE信號通路及HIF-1信號通路與炎癥亦密切相關，研究表明二者均可以激活NF-κB，從而促使其下游炎癥因子的激活〔45,46〕；(2)抗氧化應激，活性氧激活AGE-RAGE信號通路后,可激活氧化酶產生大量的活性氧,并且會進一步激活MAPK等通路使NF-κB發生磷酸化而活化,從而釋放多種趨化因子、炎癥因子及黏附因子如TNF-α等，導致機體的損傷〔47〕。而氧化應激同時可作用于PI3K-Akt信號通路，促使氣道及肺部炎癥的發生〔48〕。(3)抑制氣道重塑，趙向〔49〕研究發現阿奇霉素可通過抑制PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α/VEGF通路來改善哮喘小鼠氣道重塑，證明PI3K-Akt、HIF-1信號通路與肺組織氣道重塑的相關性。AGE-RAGE信號通路可以增強TGF-β1，促使TGF-β1和結締組織生長因子表達增多，同時其尚可以刺激血管內皮生長因子(VEGF)的生成。綜上所述，瓜蔞薤白半夏湯可通過上述通路發揮抗炎、抗氧化、抑制氣道重塑等方面作用治療COPD，但其強弱作用仍需進一步探討。

本研究采用網絡藥理學及分子對接技術探討瓜蔞薤白半夏湯治療COPD的作用機制，篩選出主要化合物為槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素、黃芩素、豆甾醇、羥基芫花素、松柏苷、香葉木素等，這些化合物對于多數靶標都起到干預作用，同時分子對接結果顯示主要化合物與PPI核心基因結合度較好，更加驗證了本次研究的結果。同時通過GO富集分析和KEGG富集分析，預測出瓜蔞薤白半夏湯可能是通過AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、IL-17信號通路、TNF通路、HIF-1信號通路及其相互作用起到抗炎、抗氧化、抑制氣道重塑的作用，體現出中藥復方的多通路、多靶點的特性。綜上所述，本文預測出瓜蔞薤白半夏湯治療COPD的相關化合物、通路、靶點為以后的研究提供了參考，但不足之處是只做了分子對接驗證及未考慮各成分的含量及合用時成分的變化，希冀能在后期動物實驗中進行完善和驗證。