N-α乙酰基轉移酶表達對順鉑抑制人食管鱗癌ECA109細胞敏感性的影響

武興剛 黃文華 董星星 趙伯文 張祥鑫 魏育濤，3

(1石河子大學醫學院第一附屬醫院，新疆 石河子 832000；2贛州市立醫院心胸外科;3濟寧市第一人民醫院胸外科)

N-α乙酰基轉移酶(Naa10) 在人體各種組織細胞內表達，參與蛋白質乙酰化修飾，在調控機體病理生理等生物學進程中扮演重要的角色〔1〕。研究發現Naa10基因在部分惡性腫瘤組織中表達上調，對腫瘤的發生、進展和侵襲起關鍵作用，有望成為檢測部分惡性腫瘤的生物標志物和治療靶點〔2，3〕。有關Naa10在腫瘤化療耐藥方面的影響研究較少，但有報道發現其可通過影響細胞凋亡從而改變腫瘤細胞對化療藥物的敏感性〔4，5〕。目前食管癌常用的治療方式有內鏡治療、外科食管癌根治術、放射治療、藥物治療等〔6〕。但食管癌患者長期預后較差，臨床上常用化療藥物有順鉑、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、表柔比星、卡培他濱等，但化療過程中，常常伴隨著食管癌對化療藥物產生耐藥性。因此，尋找新型的治療策略，提高食管癌對化療藥物敏感性，從而延長食管癌患者預后較為重要。本研究探討Naa10表達對順鉑抑制人食管鱗癌ECA109細胞敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1細胞株、試劑與儀器 人食管鱗癌細胞ECA109來源于中科院細胞庫，RPMI1640培養基( 美國 Gibco公司，貨號31800022)；胎牛血清(以色列BI公司)；胰蛋白酶(美國Gibco 公司)；順鉑(DDP，合肥巴斯夫生物科技有限公司)；Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司)；細胞毒性測定(CCK)-8(日本同仁公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus IX51)；離心機(上海安亭科學儀器廠)；酶標儀(美國 Bio-Rad公司，iMark Microplate Reader Model 680)；二氧化碳(CO2)培養箱(美國Thermo公司)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養 人食管鱗癌ECA109細胞在含10%的胎牛血清的RPMI1640完全培養基中，37℃、5% CO2培養箱中培養。細胞傳代時使用0.25%胰酶消化3～4 min 后，待倒置顯微鏡下見細胞圓縮時，加入含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養基終止消化，以移液槍輕輕吹下貼壁生長細胞，輕柔吹打均勻后分至提前加入培養基的細胞培養瓶中，放入37℃、5%CO2培養箱中培養。細胞凍存時配制凍存液1 ml〔100 μl二甲基亞砜(DMSO)+900 μl胎牛血清〕，靜置20 min，按照細胞傳代的操作方法離心得到細胞，棄上清，使用提前配制好的凍存液重懸細胞，用移液槍將細胞輕柔緩慢吹打均勻，移入凍存管，放入凍存盒內。4℃保存20 min，-20℃保存1 h后，置于-80℃冰箱內保存。

1.2.2向ECA109細胞轉染小干擾RNA(siRNA)及轉染效率鑒定 由上海吉瑪制藥技術有限公司對siRNA進行構建、包裝和純化。將人食管鱗癌ECA109細胞鋪至24孔板，將siRNA-Naa10和siRNA-NC分別轉染人食管鱗癌ECA109細胞系，設立不同的Lip2000與siRNA比例，轉染完成后，放入培養箱中，經過5 h，更換成完全培養基，移至熒光顯微鏡下觀察，確定最佳轉染效率及最低細胞毒性的Lip2000與siRNA比例，并用Western印跡檢測Naa10的表達狀況。

1.2.3Western印跡檢測 分別取轉染后48 h及72 h細胞，用細胞裂解液提取各分組樣品的總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，將制備好的蛋白加入5×上樣緩沖液，沸水浴8 min使蛋白變性，每組蛋白取3 μl上樣，進行蛋白凝膠電泳，待溴酚藍至凝膠底部時停止電泳，將電泳開的蛋白叢凝膠上電轉至硝酸纖維素膜(NC膜)，后將NC膜浸入含5%(質量分數)脫脂奶粉的TBST中室溫封閉2 h，將一抗使用5%牛血清蛋白(BSA)按1∶1 000稀釋浸潤NC膜，4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜后，將條帶充分浸潤于辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)中室溫孵2 h，再次洗膜后使用增強化學發光(ECL)方法進行顯影、曝光，膠片晾干后，掃描并分析。使用ImageJ(V2.1)軟件對目的蛋白與內參進行灰度對比。

1.2.4CCK-8法檢測各細胞組對DDP的敏感性 將ECA109-siRNA-Naa10組、ECA109-siRNA-NC組和ECA109-空白組分別以4×103個/孔接種于96孔板(100 μl/孔)，間隔24 h，待細胞完全貼壁后，各孔加入不同濃度的DDP進行培養，濃度分別為1、2、4、6、8、10、20、30、40、50、70 μg/ml，相對應的對照組使用等容積的0.9% NaCl溶液代替DDP，每組每種濃度設3個復孔，充分混勻后置37℃、5%CO2培養箱中孵育。24 h后更換培養基，每孔加含有10%的CCK-8試劑的培養液。混勻后培養箱中繼續孵育2 h，全自動酶標儀上以波長450 nm測定吸光度值A450，計算平均細胞存活率，以藥物濃度的對數值為橫坐標，細胞抑制率為縱坐標，繪制回歸直線，并計算出半數抑制濃度(IC50)值。每個處理組進行3次重復實驗，確定細胞對藥物敏感程度的改變。計算公式如下：細胞存活率=處理組A450值/對照組A450值×100%；耐藥指數(RI)=處理組細胞IC50 /對照組IC50。

1.3統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1siRNA轉染效率的確定 熒光顯微鏡下分別觀察ECA109-siRNA-Naa10組、ECA109-siRNA-NC組、ECA109-空白組，發現lip2000與siRNA比例為10 μl∶10 μl的轉染效率可達到80%以上，且對各細胞組毒性較小，故選取Lip2000∶siRNA為10 μl∶10 μl用于轉染ECA109細胞，見圖1。Western印跡檢測siRNA轉染ECA109細胞48 h的ECA109-siRNA-Naa10組Naa10表達(0.521±0.163)明顯低于ECA109空白組(0.923±0.292)、ECA109-siRNA-NC組(0.946±0.499)，見圖2；轉染72 h的ECA109-siRNA-Naa10組Naa10表達(0.205±0.008)明顯低于ECA109-空白組(0.617±0.006)、ECA109-siRNA-NC組(0.662±0.017)，見圖3。

1～3:ECA109-空白組、ECA109-siRNA-NC組、ECA109-siRNA-Naa10組，圖3同圖2 Western印跡檢測siRNA轉染ECA109細胞48 h的Naa10表達水平

圖3 Western印跡檢測siRNA轉染ECA109細胞72 h的Naa10表達水平

2.2不同濃度DDP作用后對各處理組細胞增長的抑制作用 圖4顯示，DDP在1～70 μg/ml濃度范圍內，作用時間24 h不變的情況下，各組細胞隨著DDP藥物濃度增加，其存活率逐漸減弱。ECA109-siRNA-Naa10組細胞的IC50值〔(12.776±0.739)μg/ml〕較ECA109-siRNA-NC組〔(19.223±0.276)μg/ml〕、ECA109-空白組〔(18.526±0.568)μg/ml〕明顯減小(P<0.001)，ECA109-siRNA-NC組與ECA109-空白組細胞對DDP的敏感性基本一致，IC50值變化差異沒有統計學意義(P=0.180)。ECA109-siRNA-NC組RI為1.037、ECA109-siRNA-Naa10組RI為0.689。

圖4 不同濃度DDP作用后各組細胞的存活率

3 討 論

目前臨床上對食管癌患者主要采用手術治療輔以放化療等綜合治療手段，但其臨床治療效果及遠期預后較差，術后復發率及病死率仍然居高不下，化療藥物出現耐藥性是化療失敗的主要因素，DNA拷貝數變化、靶蛋白活性改變、DNA修復能力增強、抗凋亡能力增加等機制可能參與腫瘤化療耐藥的過程〔7〕。DDP是第一代鉑類抗腫瘤藥物，是食管癌化療過程中較為常用的一種藥物，療效確切〔8〕。研究發現在兩藥或者三藥聯合化療時，加與不加DDP，在療效上存在著顯著差別〔9〕。食管癌患者在臨床化療過程中常常會使用DDP作為基礎化療藥物，在長期使用后也不可避免地出現耐藥性。很多研究都在致力于尋找能夠抑制多藥耐藥基因(MDR)1基因及其蛋白表達的藥物〔10～13〕。

Fisher等〔14〕報道干擾Naa10后DNA修復蛋白(RAD)51表達下調，該基因是DNA修復復合體的成員之一，在DNA雙鏈損傷修復過程中發揮重要的作用，因此推測Naa10可能具有DNA修復的功能。Arnesen等〔4〕研究發現Naa10也可能同時通過其他途徑誘導腫瘤細胞對化學藥物的耐受。在宮頸癌細胞中，Naa10表達下調表達可以促進凋亡，同時增加細胞對化療藥物柔紅霉素的敏感性。上述研究表明，Naa10參與腫瘤耐藥及影響藥物敏感性的過程。有關Naa10 在食管癌對順鉑敏感性的作用機制尚未見明確報道。本研究在分子和細胞層次闡明了下調Naa10表達對食管癌藥物敏感性的調控。

本研究結果顯示，DDP作用后，ECA109-siRNA-Naa10組細胞的 IC50值明顯降低，增加了ECA109細胞對DDP的敏感性，這與先前報道的結果不盡相同〔15，16〕，可能是因為Naa10在不同種類的癌癥的藥物敏感性的影響中存在著不同的生物學意義。尚有研究〔14,17～19〕表明，Naa10表達對腫瘤細胞生物學功能影響不全一致，在部分腫瘤中可以促進細胞周期進行，從而促進腫瘤細胞增殖，但也有研究認為 Naa10能抑制腫瘤增殖〔20〕。不同腫瘤細胞的凋亡過程中Naa10也同樣起雙重作用〔21，22〕。所以Naa10在不同腫瘤中對化療藥物的作用可能會表現出不同的敏感性的明確機制還需要更多的研究進一步證實。

綜上，本研究成功構建以低表達Naa10的食管癌細胞株，發現低表達Naa10能夠增強食管癌細胞對DDP的敏感性，這對食管癌耐藥研究鋪墊了基礎，有望對現有化療方案進行進一步優化，尤其是在耐藥性產生后發揮重要作用。