黃杞總黃酮對慢性心力衰竭大鼠AT1/CARP信號通路及心肌自噬的影響

解娜 王建發 楊秀麗 殷國田 趙國安

(新鄉醫學院 1第三附屬醫院心內科，河南 新鄉 453000；2第一附屬醫院心內科)

心力衰竭(HF)是由心臟結構或功能性疾病引起的心室充盈和/或射血功能受損所致〔1〕。血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1)可導致心肌細胞肥大。AT1激活了幾種細胞內信號轉導途徑，在沒有高血壓的情況下，AT1局部過表達也可能促成心肌肥大的發病機制〔2〕。心肌錨定重復蛋白(CARP)為人內皮細胞中的細胞因子(白細胞介素-1、腫瘤壞死因子-α)誘導型轉錄輔因子〔3，4〕。研究表明，CARP既是核轉錄的輔助因子，又是肌小節Ⅰ帶中與肌動蛋白相關的伸展感覺復合體的組成部分，參與肌原纖維的組裝和伸展感覺。動物模型發現肥厚型心肌細胞中CARP的表達顯著上調。在因擴張型心肌病，局部缺血性心臟病和心律失常性右室心肌病導致代償性HF的患者中也觀察到相同現象〔5〕。在生理條件下，自噬可以清除心肌細胞中的衰老細胞器和受損的蛋白質，以維持心臟功能和心臟形狀，在心臟病中，自噬水平的改變也可能導致受損的線粒體積聚，從而影響心臟功能〔6〕。黃杞總黃酮具有很強的抗氧化和消除自由基作用，黃杞總黃酮參與了磷酸與花生四烯酸的代謝、蛋白質的磷酸化、鈣離子的轉移、自由基的清除、抗氧化活力的增強、氧化還原作用、螯合作用和基因的表達〔7〕。黃杞總黃酮具有抗炎癥、抗過敏、抑制細菌、抑制寄生蟲、抑制病毒、防治肝病、防治心血管疾病、防治血管栓塞、防治心與腦血管疾病、抗腫瘤、抗化學毒物的療效〔8〕。本研究擬探討黃杞總黃酮對慢性HF大鼠AT1/CARP信號通路及心肌自噬的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級SD大鼠購自重慶醫科大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK(渝)2019-0011，動物使用許可證號：SYXK(渝)2019-0013，動物質量合格證號：NC00190346；雌雄不限，10～12周齡，體重220～300 g。大鼠在12∶12 h的明暗周期中飼養，并飼喂標準飲食和純凈水。本動物實驗經新鄉醫學院第三附屬醫院倫理委員會批準執行。

1.2主要藥物、試劑及儀器 黃杞總黃酮(原料藥，純度≥98%，南京森貝伽生物科技有限公司，批號SW30117)；纈沙坦片(北京諾華制藥有限公司，規格40 mg/片，批號20190811)；細胞自噬染色檢測試劑盒(MDC法)、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號G0170-100T、FS-14993)；TRIzol試劑(北京柏萊斯特科技發展有限公司，批號LGTZ001)；第一鏈cDNA合成試劑盒(艾美捷科技有限公司，批號NGB-54400)；SYBR Green PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(凱杰生物工程深圳有限公司，批號208059)；蛋白質提取試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所，批號SF2672-25、P0006)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(德國默克密理博公司，批號SVLP04703)；AT1單克隆抗體、CARP單克隆抗體、β-肌動蛋白(actin)單克隆抗體(英國Abcam公司，批號sc-22006、sc-53566、sc-0016)；羊抗鼠二抗(上海中科英沐生物科技有限公司，批號PB001F7)；增強型化學發光試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，批號YK-10P2)；GE 730型彩色多普勒超聲診斷儀(美國通用電氣公司)；BX53TR型熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；E100型光學顯微鏡(日本尼康公司)；7300型實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(美國ABI公司)；Tanon 5200型化學發光成像系統(上海天能科技有限公司)。

1.3動物建模及給藥 將72只大鼠通過戊巴比妥鈉腹膜麻醉，于胸骨左緣第3、4肋間開胸，暴露心臟，使用6.0無創縫合線用于結扎左前降支(LAD)冠狀動脈(距左心耳和肺動脈椎體之間的主動脈根3～4 mm)?？p合胸壁后發現共8只大鼠死亡，且術后1 w，行心臟彩超檢測，當左心室射血分數(LVEF)<45%視為慢性心力衰竭大鼠模型制備成功〔6〕。共成功造模64只大鼠，將造模成功的大鼠按隨機數表法分成4組：模型組、纈沙坦組〔9〕(50 mg/kg)、黃杞總黃酮低、高劑量組(250、500 mg/kg)〔7〕，每組16只。另取16只無任何處理措施的大鼠為對照組。纈沙坦組、黃杞總黃酮低、高劑量組于建模成功后第1天，給予相應藥物灌胃，灌胃體積10 ml/kg，對照組及模型組灌胃等體積的生理鹽水，每天1次，連續給藥4 w。

1.4超聲心動指標的測定 使用彩色多普勒超聲診斷儀進行超聲檢查，使用二維超聲心動圖顯示左心室的長軸，測量與心臟功能相關的參數，如左心室舒張末期內徑(LVIDd)、左心室收縮末期內徑(LVIDs)、左心室短軸縮短率(FS)、射血分數(EF)。

1.5心肌自噬指數的測定 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，并將其頸椎脫臼處死，剝離心臟，獲取心肌組織。常規制作心肌組織切片，MDC法測定細胞自噬水平。操作如下：將切片用PBS洗滌5 min兩次后，向每個切片中加入0.05 mmol/L MDC，在37℃的保護下避光孵育1 h，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，將載玻片固定在用PBS洗滌并固定后在4%多聚甲醛中放置15 min。通過熒光顯微鏡觀察細胞，細胞質內出現酸性自噬小體(綠色)，說明細胞發生自噬。每個標本捕獲5張圖像，記錄心肌細胞和自噬細胞的總數并計算平均值。自噬指數的計算公式如下：自噬指數=自噬細胞數/心肌細胞總數×100%。

1.6大鼠心肌病理結構觀察 將心肌組織制備石蠟切片(5 m/片)，采用HE試劑盒染色后置于光學顯微鏡下觀察。

1.7qRT-PCR測定心肌組織AT1、CARP mRNA水平 TRIzol試劑從大鼠心肌組織提取總RNA，使用第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。使用SYBR Green PCR Kit試劑盒進行定量PCR擴增。引物由碧云天生物技術研究所合成。AT1引物正向5′-GTTCTGGAATTGCGTGCTTT-3′，反向5′-TGCTTCATGAGCCAAGTCAC-3′；CARP引物正向5′-TTGATGTCCAGCTGAGTYCCT-3′，反向5′-CTTGAAGGGATCGCTCATGT-3′。β-actin用作內部對照，β-actin引物正向5′-TGGGTATGGAATCCTGTGGCA-3′、反向5′-TGTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3′。循環程序如下：95℃ 2 min，然后在95℃變性持續5 s 30個循環，在56℃退火30 s，在68℃延伸30 s。PCR總反應體積為20 μl，包含10 μl SYBR Green PCR Kit，0.8 μl正向引物，0.8 μl反向引物，2 μl cDNA模板和6.4 μl ddH2O。采用2-ΔΔCt法計算AT1、CARP mRNA的相對表達水平。

1.8Western印跡測定心肌組織AT1、CARP蛋白水平 將心肌組織樣品裂解30 min，并使用蛋白質提取試劑盒提取總蛋白，通過Bradford試劑盒測定蛋白質濃度，隨后將等量的蛋白質(20 μg)加載到聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠的每個泳道上，電泳在80 V(堆積凝膠)/ 120 V(分離凝膠)的恒定電壓下進行，將蛋白質樣品電印跡到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉將膜封閉1 h，然后加入AT1、 CARP、β-actin一抗(均為1∶1 000)在4℃下孵育過夜。加入羊抗鼠二抗(1∶5 000)與膜在室溫下孵育1 h，通過增強型化學發光試劑進行觀察。使用化學發光成像系統獲取結果，計算AT1、 CARP蛋白和β-actin蛋白(作為內部對照)的密度比，作為相對表達量。

1.9統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠心功能指標比較 與對照組比較，模型組大鼠LVIDd、LVIDs升高，FS、EF降低(P<0.05)。與模型組比較，纈沙坦組、黃杞總黃酮低高劑量組LVIDd、LVIDs明顯降低，FS、EF明顯升高；且黃杞總黃酮高劑量組LVIDd、LVIDs明顯低于黃杞總黃酮低劑量組，FS、EF明顯高于黃杞總黃酮低劑量組(P<0.05)。與纈沙坦組比較，黃杞總黃酮低劑量組LVIDd、LVIDs升高，FS、EF降低(P<0.05)。黃杞總黃酮高劑量組LVIDd、LVIDs、FS、EF與纈沙坦組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2各組大鼠心肌細胞自噬情況比較 與對照組〔(8.96±3.54)%〕比較，模型組大鼠自噬指數水平明顯升高〔(56.96±4.29)%,P<0.05〕。與模型組比較，纈沙坦組〔(21.63±4.99)%〕、黃杞總黃酮低劑量組〔(41.63±5.96)%〕、黃杞總黃酮高劑量組〔(20.47±5.87)%〕自噬指數水平明顯降低，且黃杞總黃酮高劑量組自噬指數水平明顯低于黃杞總黃酮低劑量組(P<0.05)。與纈沙坦組比較，黃杞總黃酮低劑量組自噬指數水平明顯升高(P<0.05)。黃杞總黃酮高劑量組自噬指數水平與纈沙坦組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌細胞自噬顯微觀察(甲基綠染色，×400)

2.3各組大鼠心肌組織病理結構比較 對照組心肌結構正常；模型組心肌橫紋紊亂，心肌細胞明顯腫脹，出現空泡情況(箭頭所示)，肌纖維溶解明顯，有明顯炎癥細胞浸潤；纈沙坦組及黃杞總黃酮高劑量組心肌炎癥細胞浸潤減少，心肌纖維排列整齊；黃杞總黃酮低劑量組心肌仍有明顯病理變化。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織病理(HE染色，×400)

2.4各組大鼠心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平比較 與對照組比較，模型組大鼠心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，纈沙坦組、黃杞總黃酮低、高劑量組心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平明顯降低；且黃杞總黃酮高劑量組心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平明顯低于黃杞總黃酮低劑量組(P<0.05)。與纈沙坦組比較，黃杞總黃酮低劑量組心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平明顯升高(P<0.05)。黃杞總黃酮高劑量組心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平與纈沙坦組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2，圖3。

表2 各組大鼠心肌組織AT1、CARP mRNA及蛋白水平比較

1～5：對照組，模型組，纈沙坦組，黃杞總黃酮低劑量組，黃杞總黃酮高劑量組圖3 各組大鼠心肌組織AT1、CARP蛋白表達

3 討 論

黃杞總黃酮是許多中草藥的有效成分。在自然界中最常見的是黃酮和黃酮醇，其他包括雙氫黃(醇)、異黃酮、雙黃酮、黃烷醇、查爾酮、橙酮、花色苷及新黃酮類等。由于黃杞總黃酮分子量小，可被人體迅速吸收，能通過血腦屏障，具有保護血管、防動脈硬化、擴張毛細血管、疏通微循環、活化大腦及其他臟器細胞的功能〔10，11〕。黃杞總黃酮可有效清除體內的氧自由基，黃杞總黃酮可以抑制油脂性過氧化物的全階段溢出，這種阻止氧化的能力是維生素E的10倍以上，這種抗氧化作用可以阻止心肌細胞的自噬〔12〕。此外，黃杞總黃酮可改善血液循環，降低膽固醇，這些作用大大降低了心腦血管疾病的發病率，也可改善心腦血管疾病的癥狀〔13〕。本研究說明，黃杞總黃酮對慢性HF大鼠心功能機心臟病理改變有明顯保護作用，這與上述討論一致。

心臟在病理情況下，隨著內部環境和應力條件的變化(例如缺乏能量、氧化損失和線粒體膜通透性過渡孔的開放)，心肌細胞自噬將相應增強。研究表明，自噬對于維持心臟功能至關重要，心肌細胞自噬水平的升高可引起細胞器功能障礙，例如線粒體鈣離子的積累〔14〕。本研究說明，黃杞總黃酮能明顯降低心肌細胞自噬水平，進而保護慢性HF大鼠心功能。

AT1通過作用于心肌細胞的特定受體誘導心臟重構，AT1是G蛋白耦聯受體家族成員，血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導的心肌肥大主要由AT1介導。Ang Ⅱ的正性變力和變力作用會增加耗氧量〔15〕。AT1激活特定的酪氨酸激酶途徑并引起酪氨酸磷酸化，然后激活細胞外調節蛋白激酶(ERK)1/2、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和蛋白酪氨酸激酶(JAK)。JNK可以通過培養的新生大鼠心肌細胞中的Ang Ⅱ通過AT1激活〔16〕。ERK是促分裂原活化蛋白激酶家族的關鍵成員，與Ang Ⅱ誘導的心肌肥大密切相關。JAK/轉錄激活因子(STAT)途徑是與Ang Ⅱ誘導的心肌肥大密切相關的另一種途徑，它不同于促細胞分裂劑激活的蛋白激酶家族〔17〕。細胞實驗發現缺氧的H9C2細胞及缺血/再灌注(I/R)期間的大鼠心肌中AT1表達持續升高。在阿霉素誘導的心肌病心肌中也觀察到AT1表達升高，與心肌細胞自噬和細胞丟失有關。最近的研究表明，AT1可能加重Ang Ⅱ或壓力超負荷引起的心肌細胞自噬〔18〕。越來越多的證據表明細胞自噬發生在各種心血管疾病中，包括肥厚性心肌病，缺血性心臟病和充血性心力衰竭。心肌細胞自噬促進心臟疾病的發展和進程，是重要的治療靶點〔19〕。研究發現CARP在大鼠胚胎心臟H9C2細胞中表達，與DNA損傷基因153(GADD153)基因密切相關，并受到缺氧的雙重調控，GADD153過表達加重H9C2細胞自噬，而CARP表達隨之下調；還顯示出CARP通過抑制ERK1/2和轉化生長因子(TGF)-β信號傳導途徑來減輕心肌肥大，而與心肌細胞自噬無關〔20〕。CARP還作為核轉錄輔因子，已被證明對心臟基因表達和心臟形態發生負調控。動物實驗證明了CARP在受缺氧/復氧(H/R)損傷的培養的心肌細胞中均下調，它們都是公認的自噬模型〔21〕。本研究結果提示，黃杞總黃酮可抑制心肌AT1、CARP mRNA和蛋白水平，進而抑制AT1 CARP信號通路的激活，從而抑制心肌自噬。

綜上，黃杞總黃酮對慢性HF大鼠心肌功能及心臟病理改變有明顯保護作用，能明顯降低心肌細胞自噬水平；其機制可能與黃杞總黃酮可抑制心肌AT1、CARP mRNA和蛋白水平，進而抑制AT1/CARP信號通路的激活有關。