夏枯草通過miR-663a調控ILK對BRAF陽性甲狀腺乳頭狀癌細胞侵襲的影響

陳紅躍 武紅園 婁永慶 楊萌萌 栗粟

(1河南省中醫院甲狀腺乳腺科，河南 鄭州 450000；2河南中醫藥大學第二臨床醫學院外科學)

甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是常見的甲狀腺惡性腫瘤病理類型之一，其發生與多種基因相關，研究表明鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1(BRAF)在PTC中存在普遍的突變與過表達，且BRAF突變型的PTC侵襲性強，預后差〔1〕。因此抑制細胞侵襲是治療BRAF陽性PTC的重中之重。研究表明中藥活性成分有抑制PTC的作用，如姜黃素可抑制PTC的TPC-1細胞侵襲和遷移〔2〕。夏枯草(PV)是臨床常用中藥，具有抗感染、免疫抑制、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等多種藥理作用〔3〕。研究報道PV能抑制人PTC細胞K1和人甲狀腺髓樣癌TT細胞增殖并誘導其凋亡〔4，5〕。PV還能抑制PTC的TPC-1細胞增殖〔6〕。且PV提取物可抑制食管癌Eca-109細胞體外侵襲和轉移〔7〕。但PV對BRAF陽性PTC細胞侵襲的影響及其機制尚不清楚。研究表明PTC患者血清中miR-663低表達，與PTC細胞侵襲和轉移密切相關〔8〕。miR-663上調通過靶向轉化生長因子(TGF)β1抑制PTC細胞的侵襲和遷移〔9〕。整合素連接激酶(ILK)是整合素和生長因子等多種信號通路中的效應分子，在腫瘤細胞的血管生成、凋亡、轉移和細胞周期過程中發揮重要作用〔10〕。ILK影響PTC細胞的信號傳導途徑和遷移，并且是潛在的治療靶標〔11〕。本研究旨在探討PV通過miR-663a調控ILK對BRAF陽性PTC細胞侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料 正常甲狀腺細胞HT-ori3和PTC細胞TPC-1購自上海澤葉生物科技有限公司；RPMI1640培養基、胎牛血清購自美國Sigma公司；PV顆粒(編號：B14000020441，國藥準字：Z20050519，規格：2 g×8袋)產自江蘇晨牌藥業集團股份有限公司；細胞計數試劑盒(CCK)-8購自上海善然生物科技有限公司；Transwell小室、基質膠購自美國 Bio-Rad公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液購自上海羽朵生物科技有限公司；基質金屬蛋白酶(MMP)-9、血管內皮生長因子(VEGF)、ILK、β-actin抗體購自上海斯信生物科技有限公司；山羊抗兔IgG二抗購自北京百奧萊博科技有限公司；Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購自北京麥瑞博生物科技有限公司；雙熒光素酶報告檢測試劑盒購自武漢純度生物科技有限公司；Thermo FC酶標儀購自美國Thermo公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2細胞藥物處理與分組 正常甲狀腺細胞HT-ori3和PTC細胞TPC-1在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養液中培養，取對數生長期細胞TPC-1，分別用濃度0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml的PV培養，作為不同濃度PV組，其中2.0 mg/ml PV組記為PV組；不作任何處理的細胞作為對照(Control)組。將anti-miR-con、anti-miR-663a、ILK過表達質粒轉染至TPC-1細胞中，再用2 mg/ml PV處理，記為PV+anti-miR-con組、PV+anti-miR-663a組、PV+ILK組。

1.3CCK-8檢測細胞增殖活力 各組培養48 h后，每孔中加入10 μl CCK-8試劑，孵育2 h后，酶標儀檢測各組細胞490 nm波長處的吸光度值(OD)。細胞增殖活力(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。實驗重復3次。

1.4Transwell檢測細胞侵襲 Transwell小室上室加入100 μl稀釋的基質膠，十字搖勻，靜置凝固；然后加入100 μl細胞懸液，其中下室加入500 μl含血清培養液，37℃培養24 h，0.1%結晶紫染色30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2遍，棉簽擦拭掉上層未穿過基底膜的細胞，光學顯微鏡(×200)下隨機選擇5個視野，拍照記錄并進行細胞計數。實驗重復3次。

1.5Western印跡檢測MMP-9、VEGF、ILK蛋白表達 提取細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。將蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉至聚偏氟乙烯膜上，封閉液室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜，加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，電化學(ECL)發光液顯影，ChemiDoc XRS+系統成像，Quantity One分析蛋白條帶灰度值，蛋白相對表達水平=目的條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。每個蛋白樣品設3個重復。

1.6實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-663a和ILK mRNA表達水平 各組細胞培養48 h，提取總RNA，將RNA反轉錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說明進行PCR，每個樣品設3個重復，循環條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環；60℃延長5 min。相對表達量用2-△△Ct法計算。miR-663a和ILK分別以U6和β-actin為內參，miR-663a上游引物：5′-AGCAGAGGCGGGGC-GCCGCGGG-3′，下游引物：5′-GTGCA GGGTCCGAGGT-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAA TTTGCGT-3′；ILK上游引物：5′-GGCTCAGGAT TTTCTCGCA-3′，下游引物：5′-CTGCTGAGCGTCTGTTTGTG-3′；β-actin上游引物：5′-TGGATGATGATATCGCCGC-3′，下游引物：5′-GTAGATGGGCACAGTGTGGGT-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.7雙熒光素酶報告實驗驗證miR-663a和ILK的靶向關系 使用PCR擴增包含miR-663a結合位點的ILK序列片段，并構建至熒光素酶表達載體中，獲得ILK野生型載體，將ILK序列GCCCCGCC突變為CGGGGCGG，獲得ILK突變型載體，將其分別與miR-con、miR-663a共轉染至TPC-1細胞中，轉染48 h后，按照雙熒光素酶報告檢測試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

1.8統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1PV對BRAF陽性PTC細胞TPC-1增殖的影響 與Control組細胞活力〔(1.07±0.08)%〕比較，0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml PV組〔(0.91±0.07)%、(0.79±0.06)%、(0.56±0.04)%、(0.40±0.04)%〕均顯著降低(P<0.05)。后續實驗選擇濃度2.0 mg/ml的PV。

2.2miR-663a和ILK在TPC-1細胞中的表達 與正常甲狀腺細胞HT-ori3相比，TPC-1細胞中miR-663a表達水平顯著降低，ILK mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western印跡檢測ILK在TPC-1細胞中的表達

表1 miR-663a和ILK在TPC-1細胞中的表達

2.3miR-663a與ILK的靶向關系 StarBase數據庫預測顯示miR-663a與ILK存在結合位點，見圖2。熒光素酶報告實驗顯示，與miR-con組相比，miR-663a組轉染野生型表達載體WT-ILK的TPC-1細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉染突變型表達載體MUT-ILK的TPC-1細胞熒光素酶活性無顯著差異(P>0.05)，見表2。

圖2 miR-663a與ILK的結合位點

表2 雙熒光素酶實驗

2.4PV通過miR-663a抑制ILK的表達 與Control組相比，PV組miR-663a表達水平顯著升高，ILK mRNA和蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)。與PV+anti-miR-con組相比，PV+anti-miR-663a組miR-663a表達水平顯著降低，ILK mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖3，表3。

1～4：Control組，PV組，PV+anti-miR-con組，PV+anti-miR-663a組圖3 Western印跡檢測PV和miR-663a對TPC-1細胞ILK表達的影響

表3 PV和miR-663a對TPC-1細胞ILK表達的影響

2.5PV通過miR-663a調控ILK對TPC-1細胞增殖、侵襲的影響 與Control組相比，PV組細胞活力顯著降低，侵襲細胞數、MMP-9、VEGF表達水平均顯著降低(P<0.05)；與PV組相比，PV+anti-miR-663a組和PV+ILK組細胞活力顯著升高，侵襲細胞數、MMP-9、VEGF表達水平均顯著升高(P<0.05)。見圖4，圖5，表4。

1～4：Control組、PV組、PV+anti-miR-663a組、PV+ILK組圖4 PV通過miR-663a調控ILK對TPC-1細胞侵襲相關蛋白表達的影響

圖5 PV通過miR-663a調控ILK對TPC-1細胞侵襲的影響(結晶紫，×200)

3 討 論

PTC是最常見的甲狀腺惡性腫瘤，大部分經手術治療后預后較好，但仍有一部分PTC具有高侵襲性，難治愈〔12〕。研究報道PV對不同病理類型的人甲狀腺癌細胞均有不同程度的抑制增殖作用〔13〕。PV可能通過激活線粒體通路誘導人PTC細胞凋亡〔14〕。PV能抑制人甲狀腺癌細胞系SW579細胞生長，并誘導細胞凋亡而阻止細胞周期〔15〕。本研究結果說明PV可抑制TPC-1細胞增殖、侵襲。血管生成是腫瘤生長、侵襲、轉移的基礎，VEGF可調控血管生成，與腫瘤的增殖、侵襲和轉移密切相關〔16〕。PTC組織中VEGF陽性表達率高，與TNM分期及有無淋巴結轉移有關〔17〕。本研究結果表明PV抑制TPC-1細胞侵襲可能與VEGF有關。

研究表明miRNA參與PTC的多種生物學過程，與細胞侵襲性作用機制有關，還可作為臨床診斷、復發監測及預后判斷等標志物〔18〕。過表達miR-663a可顯著抑制膀胱癌EJ和5637細胞的增殖、遷移和侵襲能力〔19〕。miR-663a通過調節TGFβ1抑制肝癌細胞的生長和侵襲〔20〕。本研究結果表明miR-663a低表達會促進TPC-1細胞增殖、侵襲；PV可能通過升高miR-663a的表達抑制TPC-1細胞侵襲。

研究顯示miRNA通過與靶mRNA的3′UTR結合使靶基因降解或沉默，進而影響腫瘤的發生發展〔21〕。本研究結果說明PV可能通過miR-663a調控ILK的表達；ILK表達水平也會影響PV對TPC-1細胞侵襲的作用。且有研究報道VEGF和ILK均參與了胃癌細胞的生長、侵襲和轉移過程，VEGF和ILK在胃癌中的表達存在正相關，ILK可能通過信號轉導途徑啟動VEGF的表達，促進腫瘤早期的血管發生和形成〔22〕。提示ILK對TPC-1細胞侵襲的作用可能也與VEGF有關。

綜上，PV可通過上調miR-663a進而下調ILK抑制BRAF陽性PTC細胞侵襲，且其可能與VEGF的表達有關。