NGF聯合抗VEGF對糖尿病模型大鼠視網膜組織中氧化應激和VEGF表達的影響

孫鵬 孟巖 張劍 齊艷秀 劉宏偉

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

糖尿病是嚴重影響人們健康的一種慢性代謝性疾病，日益受到國內外科研工作者的廣泛關注。在糖尿病所有類型中，2 型糖尿病最為多見，占所有病例的90%以上〔1〕。糖尿病眼病是由糖尿病引起的一類眼部并發癥的總稱，其中最典型的是糖尿病性視網膜病變(DR)，它是導致患者視力下降、受損甚至失明的主要原因〔2〕。糖尿病眼病的發病機制錯綜復雜，諸多血管刺激和抑制因子在其演進過程中發揮重要調節功能，血管內皮生長因子(VEGF)因其具有顯著的促血管生成作用，故其在糖尿病眼病病理過程中的作用備受人們關注〔3〕。有關研究報道，在糖尿病眼病的演進過程中，可檢測到VEGF表達和水平的增加，但對于糖尿病眼病的各時間段VEGF水平的具體情況沒有進行深入探討〔4〕。在糖尿病的模型制備中，目前人們主要以大鼠為研究對象，通過注射鏈脲佐菌素(STZ)來促使其發展為糖尿病模型〔5〕。本研究利用STZ誘導大鼠構建糖尿病模型，并利用神經生長因子(NGF)和抗VEGF進行干預后，觀察大鼠血清血糖和VEGF的變化，檢測大鼠視覺電生理視網膜暗反應(ERG)，并研究大鼠視網膜組織氧化應激水平和VEGF含量，以明確抗VEGF藥物對糖尿病大鼠視網膜病變的防治作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選用清潔級(SPF)8周齡健康雄性Wistar大鼠(體重210～250 g)80只(長春億斯實驗動物技術有限責任公司)，分籠(5只/籠)飼養。動物采用自由飲水攝食飼養，飼養條件為：空氣相對濕度50%～70%，環境溫度19～22℃，明暗交替光照周期為12 h/12 h。

1.2實驗儀器與試劑 鏈佐霉素(美國Sigma公司)；水合氯醛(廣州市醫藥公司)；VEGF一抗(武漢博士德公司)；二步法免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋公司)；濃縮型二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒(北京中杉金橋公司)；MP150生理記錄儀(美國BioLab公司)；組織脫水機(武漢俊杰電子有限公司)；石蠟切片機、展片機(德國Leica公司)；恒溫水浴箱(北京長安科學儀器廠)。

1.3實驗分組和模型建立 將大鼠隨機平均分為正常對照組、模型組、NGF組和NGF+抗VEGF組各10只。正常對照組給予正常飲食，其他3組給予高脂高糖飲食。持續4 w后，進行造模，造模前先禁食24 h，然后模型組、NGF組和NGF+抗VEGF組腹腔注射STZ(50 mg/kg)，正常對照組則腹腔注射相同體積的檸檬酸緩沖液。造模72 h后，采集尾靜脈血檢測空腹血糖(FBG)，FBG≥16.7 mmol/L為模型制備成功。

1.4給藥 誘導糖尿病模型后繼續飼養至16 w，待模型組、NGF組和NGF+抗VEGF組出現視網膜病變后，進行如下給藥處理：NGF組在肌肉和眼球玻璃體腔內分別注射NGF和生理鹽水，NGF+抗VEGF組兩部位分別注射NGF和抗VEGF藥物，而正常對照組兩部位則注射生理鹽水，連續給予3 w。

1.5大鼠房水中VEGF和FBG含量檢測 各組實驗大鼠尾靜脈取血測FBG，眼球房內取房水采用VEGF酶聯免疫檢測試劑盒(AE98006Ra，上海聯碩生物科技有限公司)測VEGF水平。

1.6ERG檢查 大鼠暗適應1 h以上，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量為0.3 g/kg體重。麻醉狀態的大鼠固定于大鼠實驗臺上，右眼滴加復方托吡卡胺滴眼液(美多麗)散瞳，滴加鹽酸奧布卡因滴眼液(倍諾喜)表面麻醉。將記錄電極、參考電極和接地電極分別與右眼角膜表面、兩眼間和尾部進行連接。用MP150生理記錄儀進行ERG記錄，反應光強為0.38 cd·s/m2。檢測結束后，點氯霉素眼藥水以預防感染。

1.7視網膜組織中丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)含量檢測 將實驗大鼠視網膜組織進行充分研磨，并制備成10%組織勻漿液。常溫進行離心(2 000 r/min)后，收集上清液，用酶聯免疫檢測試劑盒和可見光分光光度計測定各組視網膜組織中MDA、CAT和SOD含量變化。

1.8免疫組化檢測VEGF蛋白表達 將切片進行烤片30 min；常規脫蠟、入水、抗原修復、封閉后，用抗VEGF抗體(稀釋比為1∶50)在4℃孵育過夜；用二步法免疫組化檢測試劑盒操作后，進行DAB顯色；浸入蘇木素染液5 s進行復染，然后浸入1%HCl/酒精30 s進行分化；蒸餾水徹底沖洗后，置于自來水中放置2 h；常規脫水、透明、封片后利用圖像采集系統采集并分析結果。

1.9統計學處理 采用SPSS19.0統計學軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組房水中VEGF水平和FBG比較 各組注射3 w后，與正常對照組相比，其余3組VEGF水平、FBG明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，NGF組和 NGF+抗VEGF組VEGF水平有統計學差異(P<0.05)，而FBG差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組房水中VEGF和FBG比較

2.2各組ERG檢查 各組注射3 w后，與正常組比較，模型組、NGF組ERG檢查b波潛伏期顯著延遲(P<0.05)，振幅明顯上升(P<0.05)；與模型組比較，NGF組和 NGF+抗VEGF組ERG檢查b波潛伏期顯著縮短(P<0.05)，振幅明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組ERG潛伏期和幅值變化

2.3各組視網膜組織中MDA、CAT和SOD含量檢測 各組注射3 w后，與正常對照組相比，模型組MDA含量明顯升高、CAT和SOD含量明顯降低(P<0.05)；模型組比較，NG組和NGF+抗VEGF組MDA、CAT、SOD含量差異有統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組視網膜中MDA、CAT和SOD含量測定

2.4各組VEGF蛋白表達 由免疫組化結果所見，VEGF主要表達于內叢狀層、內核層、外叢狀層及神經節細胞層。與正常對照組相比，VEGF在模型組、NGF組和 NGF+抗VEGF組的蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，VEGF在NGF組和NGF+抗VEGF組的蛋白表達水平明顯減少(P<0.05)；與NGF組相比，VEGF在NGF+抗VEGF組的表達水平明顯減少(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組眼球視網膜中VEGF蛋白檢測(免疫組化，×400)

3 討 論

隨著DR發病率程逐年上升的趨勢，DR的防治已成為糖尿病并發癥研究領域中迫在眉睫的重要課題。建立可復制性、合理性和可靠性的動物模型是深入研究DR發病機制、評判藥物治療效果及制定防治、防御措施的重要環節之一。DR實驗動物模型建立是否可行、可靠和穩定及其與人類DR的類似度，直接關系到實驗研究結果。經典的糖尿病動物模型主要包括以下4類，分別為化學物質(如STZ和四氧啼唆)誘導動物模型、自發性遺傳性動物模型、胰腺部分切除動物模型和轉基因動物模型〔6〕。STZ誘導糖尿病大鼠模型一直備受科研人員的推崇，其具有對大鼠周圍組織毒性小，模型死亡率低、穩定性高，模型建立簡便易行、操作程序簡化等特點。STZ是一種專門選擇性破壞動物胰島β細胞的藥物，其作用是通過誘導產生一氧化氮(NO)實現的。在體內，NO具有參與自由基級聯反應、抑制線粒體功能、β細胞代謝和胰島素分泌等作用，結果可使FBG升高〔7〕。然而，STZ對視網膜則沒有毒性作用。目前認為，利用STZ注射建立糖尿病動物模型的使用劑量沒有統一標準〔8〕。研究發現〔9〕，小劑量多次注射STZ可成功建立糖尿病動物模型，該方法與糖尿病發生發展的自然病程相近，能使胰島功能發生漸進性損傷，且可有效降低模型動物的死亡率。此外，有研究認為，雌性鼠建立糖尿病動物模型的成功率較雄性鼠更低，其原因與雌激素對血管具有保護作用有關〔10〕。基于此，本課題選用雄性大鼠作為研究對象。

針對視網膜電生理的研究，劉文舟等〔11〕的研究結果顯示，DR患者ERG的a、b波振幅(尤其是b波的振幅)改變敏感。在DR早期，當眼底未發生病理改變時，就可檢測到ERG異常。ERG可敏感并客觀反映出視網膜內層血液循環的狀態。尤其是在DR患者住院的前期已經出現Ops總波振幅降低并伴有子波振幅選擇性降低的現象〔12〕。所以，Ops波在DR患者早期診斷和治療效果評價有著不可替代的重要價值〔13〕。目前認為，DR早期病變中即可出現Ops總波幅變化，提示其是DR早期診斷敏感的指標之一〔14〕。此外，Ops還可反映視網膜損害的情況，沈泓等〔15〕研究表明，Ops 總波振幅與DR病情成反比，與許建華等〔16〕發表的結論一致。DR的出現再一次證明糖尿病患者的病程已經發展到不可逆的階段，眼部周圍的微環境已經受到了破壞。隨著患者病程期的延續和患者血液里FBG值持續的升高，DR出現的概率會更大〔17〕。

本實驗結果表明，VEGF蛋白表達對糖尿病眼病的發生和發展過程起到了重要作用，因糖尿病眼病患者的玻璃體VEGF濃度高，可能與玻璃體為矯治物體相關，可利于VEGF 的濃縮及儲存〔18〕。在視網膜中分泌VEGF后，滲入玻璃體中儲存。而房水中VEGF是在睫狀突形成后，經后房循環，從小梁網進入房水靜脈內，經房水中循環，從而形成 VEGF 水平上升〔19〕。已經有學者研究顯示〔20〕，玻璃體VEGF水平上升，是導致糖尿病患者出現玻璃體DR的獨立危險因素。VEGF為最新檢查出的新生血管生長因子，其具有較強的促分裂能力〔21〕。眼睛未出現病變時，視網膜周邊細胞、內皮細胞、視網膜色素上皮細胞均會形成較低的 VEGF，已經有學者研究表示〔22〕，VEGF在糖尿病眼病發展中具有重要作用。相較于未出現視網膜病變患者，視網膜病變組的 VEGF 水平明顯較高，且與血清胰島素樣生長因子(IGF)-1、胰島素抵抗呈密切相關性，在不同眼部疾病房水中，VEGF濃度同樣存在差異。研究結果顯示〔23〕，糖尿病視網膜病變患者，慢性閉角型青光眼患者及新生血管性青光眼患者VEGF水平均有明顯差異(P<0.05)。在正常情況下，組織中VEGF表達水平較低，而當組織血供豐富且代謝旺盛時，VEGF 水平將相應升高，同樣，在病理條件下，其表達也會升高。

綜上，在2型糖尿病患者DR中，VEGF 水平明顯上升，IGF-1 水平隨之上升，呈相互影響關系〔24〕。隨著我國科研工作者和世界上科研人員對糖尿病眼病的發病機制不斷深入的研究，對糖尿病眼病患者的治療技術和方法也會可獲得突飛猛進的發展。