黃芪多糖的糖含量與飲片截面積的關系及對小鼠免疫器官指數的影響

彭勤 劉曉曦

摘要 [目的]以多糖含量來評價黃芪質量，并研究黃芪多糖對小鼠免疫器官指數的影響。[方法]根據黃芪飲片大小編號為1號、2號和3號，先測量其面積，粉碎機粉碎后過20目篩，經過水提醇沉的方法提取多糖，用酶標儀測定黃芪多糖中的糖含量，選用糖含量最高的提取物制作黃芪多糖藥液（10 mg/mL）;將小鼠隨機分成2組，即對照組和黃芪多糖組（0.01 mL/g）給小鼠灌胃7 d，稱量小鼠體重，眼球采血，測量其外周血白細胞數及采集其胸腺、脾臟并稱重，比較其內臟系數和外周血白細胞數的變化。[結果]1～3號黃芪多糖的提取率分別為5.75%、5.95%和7.76%，糖含量分別為208.75、209.45和212.35 mg/g，黃芪飲片的內圈大小和多糖提取量呈正相關，3號飲片質量最佳;小鼠灌胃黃芪多糖后胸腺、脾臟系數顯著增高。[結論]黃芪多糖改善了小鼠的免疫功能。

關鍵詞 黃芪;多糖;含量;飲片截面積;小鼠;免疫器官指數

中圖分類號 R285? 文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2022）11-0159-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.11.041

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Relationship between Sugar Content of Astragalus Polysaccharide and Cross-sectional Area of Decoction Pieces and Its Effect on Immune Organ Index in Mice

PENG Qin，LIU Xiao-xi

（Department of Veterinary Medicine，Binhai Agricultural College， Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong 524000）

Abstract [Objective] The astragalus quality was evaluated by the polysaccharide content， and the effect of astragalus polysaccharide on the immune organ index of mice was studied.[Method]According to the size of astragalus decoction pieces numbered as No.1， No.2 and No.3， the area of astragalus decoction pieces was measured first.After being crushed by a pulverizer and sieved through 20 meshes， the polysaccharide was extracted by water extraction and alcohol precipitation.The sugar content in astragalus polysaccharide was determined by an enzyme labeling instrument.The extract with the highest sugar content was selected to make astragalus polysaccharide solution （10 mg/mL）;The mice were randomly divided into two groups： control group and astragalus polysaccharide group （0.01 mL/g）.The mice were gavaged for 7 days.The weight of the mice was weighed， the blood was collected from the eyeball， the number of leukocytes in peripheral blood was measured， and the thymus and spleen were collected and weighed.The changes of visceral coefficient and the number of leukocytes in peripheral blood were compared.[Result]The extraction rates of 1-3 astragalus polysaccharides were 5.75%， 5.95% and 7.76% respectively， and the sugar contents were 208.75，209.45 and 212.35 mg/g respectively.There was a positive correlation between the inner ring size of astragalus decoction slices and the extraction amount of polysaccharides， and the quality of No.3 slices was the best.After intragastric administration of astragalus polysaccharides， the coefficients of thymus and spleen increased significantly.[Conclusion]Astragalus polysaccharides improved the immune function of mice.

Key words Astragalus;Polysaccharide;Content;Cross-sectional area of decoction pieces;Mouse;Immuno-organ index

在飼料中添加安全可靠、高效的天然植物（提取物、超微粉碎物等）以增加畜禽的免疫力用來抵御疾病，是預防疾病的一項重要的營養措施[1]。黃芪味甘，性微溫，具有補氣升陽、止汗固表、消腫利尿、托毒排膿、斂瘡生肌等效果。臨床上主要是用于治療氣虛乏力、中氣下陷、氣虛水腫等[2]。近代藥理學研究發現，黃芪具有調節機體免疫、抗應激、抗病毒、抗感染等作用。

黃芪能提高機體免疫功能[3]，增加動物體內外周白細胞數[4]，添加在飼料中能提高小鼠的免疫力、加快動物機體快速恢復[5]、改善腸道菌群[6]等。黃芪主要含有黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮等類化合物， 其中黃芪多糖含量最多、免疫活性最強、應用最為廣泛[7]。提取黃芪多糖的方式有水煎煮法（水提醇沉）[8]、堿醇提取法、堿水提取法[9]、微波提取法[10]、超聲提取法[11]、超高壓提取法[12]、酶提取法[13]和基于響應面分析的提取方法等，其中水提醇沉法最常見也最簡便。市場上的黃芪質量參差不齊，甚至存在偽品黃芪冒充正品或以次充好的現象[14]。但是黃芪多糖結構較為復雜，不具備成為質控的指標條件，所以國內大多數試驗都是通過提取黃芪多糖，以總多糖來作為研究對象。但針對多糖對黃芪質量的研究較少，故質量評估方法一直是個熱門的研究方向。為建立一種更科學的品質評價指標，筆者通過水提醇沉法去提取黃芪多糖，并測定黃芪多糖中糖含量以評價飲片質量，以期為市場上評價黃芪飲片質量提供理論依據，對中草藥資源保護和發展都具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品及其來源

根據黃芪飲片大小，將飲片從大到小進行編號。黃芪1號（化州市某有限公司中藥飲片廠生產，飲片），采購于湛江市霞山區康悅大藥房;黃芪2號（北京某有限公司生產，飲片），采購于湛江市霞山區湛川大道北京同仁堂江霞分店;黃芪3號（岐山某中藥材有限公司生產，飲片），采購于湛江市大參林。6周昆明系小白鼠10只。

1.2 主要試劑 無水乙醇（分析純）;苯酚;硫酸;超純水;肝素。

1.3 測量黃芪飲片內圈大小 將購買的各樣品黃芪飲片隨機挑選5枚黃芪飲片測量其內圈的長度和寬度，記錄并求得其平均值，計算其內圈面積。黃芪飲片內圈近似橢圓形，其內圈面積的計算公式為 S= π ×A×B，式中，A為內圈的半長軸，B為內圈的 半短軸。

1.4 黃芪多糖提取

將3種黃芪飲片（黃芪1號、黃芪2號、黃芪3號）分別用萬能高速粉碎機粉碎，并過20目篩網，獲得20目的黃芪粉。用電子天平稱取100 g的黃芪粉，并加入20倍的超純水（2 L），煎煮2次（先使用1 L水煎煮1次，再用1 L水煎煮第2次），混合2次煎煮出的黃芪液。將煎煮出的黃芪液離心（10 min，2 000 r/min），取上清液蒸發濃縮至500 mL，加入無水乙醇使醇濃度達到60%，離心（10 min，2 000 r/min），棄上清液，沉淀溶于水，再加入無水乙醇使醇濃度達到40%，離心（10 min，2 000 r/min），獲得沉淀物，將沉淀物放入鼓風干燥機中干燥，獲得黃芪多糖1號、黃芪多糖2號、黃芪多糖3號，稱重并記錄數據。

1.5 酶標儀測定多糖中的糖含量

1.5.1 葡萄糖標準溶液的配制。稱取葡萄糖標準樣品20 mg，放入100 mL錐形瓶，定容，加入適量超純水溶解，稀釋至刻度，搖勻，備用。

1.5.2 苯酚溶液的制備。

稱取苯酚5 g，置于100 mL棕色容量瓶中，定容，加入適量水溶解，稀釋至刻度線，搖勻，得5%的苯酚溶液，置于4 ℃冰箱備用。

1.5.3 不同梯度葡萄糖標準溶液的制備。

量取配制好的葡萄糖標準溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0? mL，置于具塞試管中，并依次編號為1～7，并且分別補水至2 mL。將5%苯酚溶液1.0 mL加入各試管，攪拌混勻后迅速將5.0? mL硫酸加入，攪拌混勻，靜置10 min后，于水浴加熱（40 ℃）15 min，取出冷卻至室溫。不加葡萄糖的試劑為空白組。

1.5.4 全波長酶標儀標準曲線的繪制。以空白作參比，精密吸取編號為1～7的葡萄糖標準溶液各 100 μL，分別置于96孔單條可拆酶標板中，采用全波長酶標儀在 450 nm波長下測定其OD值，以葡萄糖含量為X軸、OD值為Y軸，繪制標準曲線。

1.5.5 樣品溶液的制備。精密稱取1號、2號、3號黃芪飲片提取的多糖樣品1 g，加水溶解至 100 mL，搖勻，即得1號、2號、3號樣品溶液。

1.5.6 糖含量的測定。

精密量取制備的1號、2號、3號樣品溶液1.0 mL，置于具塞試管中，精密加水1.0 mL，攪拌混勻，進行顯色操作[加入1.0 mL的5%苯酚溶液，攪拌混勻，加入5.0 mL硫酸，攪拌混勻，靜置10 min后，水浴保溫（40 ℃）15 min，取出，迅速冷卻至室溫]。在450 nm波長下，吸取編號1～3的多糖樣品溶液各100 μL，分別注入96孔單條可拆酶標板中，采用全波長酶標儀進行OD值測定，重復測定6次，根據標準曲線計算樣品糖含量。

1.6 動物試驗

1.6.1 10 mg/mL黃芪多糖藥液的配制。稱取3號黃芪多糖1 g，加入100 mL超純水，加熱攪拌溶解，獲得10 mg/mL的藥液。

1.6.2 試驗動物分組。

選用 10只（20±2）g的小鼠，編號并記錄初始體重，隨機分成兩組，分別為對照組和黃芪多糖組。將配制完成的黃芪多糖（濃度10 mg/mL）按0.01 mL/g給藥進行灌胃，黃芪多糖組每天灌胃0.2 mL，對照組則灌0.2 mL生理鹽水作空白對照，每組每次飼養需固定飼養量，每天2次，飼養 7 d。

1.6.3 小鼠脾臟、胸腺的摘除及保存并計算脾臟、胸腺臟器系數。

觀察并飼養7 d后，飼養結束。提前禁食1 d，稱重，眼球采血，收集全血，做好標記。小鼠眼球采血，收集到的全血置于裝有抗凝劑（EDTA）的立式離心管內，上下顛倒搖勻，充分混合。 將采集的血液在URIT-5810五類全自動血細胞分析儀測量外周血白細胞數，測定白細胞數并記錄。剖開小鼠腹腔，采集小鼠的脾臟和胸腺。取 4 個潔凈的 50? mL 立式離心管， 分別標記黃芪多糖組和對照組。離心管內分別倒入適量 4%甲醛溶液（溶液的量需完全浸沒組織），用以保存摘取的脾臟和胸腺。在密封、室溫條件下，固定 72 h 保存以備用。稱量并記錄各組的脾臟和體重，根據以下公式計算：胸腺、脾臟臟器系數=胸腺、脾臟的濕重/小鼠胴體重量×100%。

1.7 數據統計分析 使用Excel軟件處理測量的數據及畫圖，應用統計軟件SPSS 20.0進行2個獨立樣本的 t 檢驗。

2 結果與分析

2.1 黃芪飲片截面積與黃芪多糖提取量的相關性 從表1可以看出，3號黃芪飲片截面積最大，其次為2號，最小的是1號;3號黃芪飲片中多糖提取率提高，其次為2號，最低的為1號，1號、2號和3號黃芪飲片的多糖提取率分別為5.75%、5.95%和7.76%。由表1和圖1可知，黃芪多糖提取量與黃芪內圈大小有關，黃芪多糖提取量與黃芪飲片截面積呈正相關性，線性方程是 y=2.656 3x+4.096（R2 =0.999 7），結果表明黃芪飲片截面積在0～1.40 cm2線性關系良好。內圈越大提取的多糖量越多，反之則越少。

2.2 黃芪多糖中糖含量測定

根據酶標儀在450 nm波長下的結果，繪制OD值與葡萄糖含量的標準曲線，結果見圖2。從圖2可以看出，在450 nm波長下，全波長酶標儀測定結果的線性方程是 y=1.045 2x+0.090 1（R2 =0.986），表明葡萄糖含量在0～0.20 mg/mL線性關系良好。

經計算，1號、2號和3號黃芪多糖中糖含量分別為208.75、209.45、212.35 mg/g，可見3號黃芪多糖中含糖量最多，故判斷3號黃芪質量最好。因此，選取3號黃芪多糖開展動物試驗。

2.3 黃芪多糖對小鼠臟器指數的影響

按0.01 mL/g給小鼠灌胃給藥7 d后，發現相比于對照組，黃芪多糖組的外周血白細胞數有升高趨勢 （P >0.05）。從表2可以看出，黃芪多糖組的脾臟、胸腺的臟器指數均高于對照組，且差異顯著（ P <0.05）。

3 結論與討論

該試驗通過水煮醇沉的方法提取黃芪多糖，1號、2號和3號黃芪飲片的多糖提取率分別為5.75%、5.95%和7.76%，通過酶標儀對多糖標準品繪制的標準曲線[15]計算出1號、2號和3號黃芪飲片提取的多糖中糖含量分別為208.75、209.45和212.35 mg/g。黃芪多糖提取量與黃芪飲片截面積呈正相關，黃芪飲片截面積越大，黃芪多糖含量越多;反之則越少。黃芪飲片的截面積可作為質控指標之一。黃芪質量主要以傳統性狀分為特等、一等、二等、三等、四等[16]。水煎煮法是黃芪多糖的傳統提取方法，又被稱為水提醇沉，主要根據大部分多糖在熱水中溶解度較大而在高濃度乙醇中溶度小的原理進行提取;該方法主要的優點在于操作簡單方便、對多糖的破壞較小，是目前運用最廣最多的黃芪多糖提取方法，但其也存在一些缺點，如多糖的提取率及其糖含量普遍的偏低;試驗中由于多糖被乙醇萃取后容易黏附在玻璃器械上，導致結果有所偏差;對提取的物質的選擇性較差，提取物

成分的類別較多，不利于后期的分離純化，而且提取的物質容易變質。

小鼠灌胃7 d后，解剖采樣后發現黃芪多糖組小鼠的胸腺、脾臟系數與對照組的胸腺、脾臟系數相比增加明顯，通過數據可以發現提取出的黃芪多糖對小鼠的免疫系統有強化提升的作用，使小鼠的免疫力增強。黃芪多糖是一種藥食兩用的天然中草藥提取物，蘊含較豐富的營養物質，如多糖、維生素、微量元素、氨基酸及一些未知的生長因子等，可以促進動物的免疫器官發育、增強動物機體對疾病的抵抗力、提高動力的機體的免疫力、加快動物機體快速恢復、改善腸道菌群等。多糖也具有提升動物機體免疫力的作用，如茯苓多糖對肉雞有改善機體免疫的作用[17]、赤松茸多糖對小鼠脾臟細胞和巨噬細胞的增殖作用[18]以及枸杞多糖對肉雛雞免疫器官指數有增加作用[19]，這些多糖在畜禽養殖業各個領域中都有很好的應用效果。

綜上所述，黃芪飲片的內圈大小與多糖提取量呈正相關，3號飲片質量最佳;小鼠灌胃黃芪多糖后胸腺、脾臟系數顯著增高，表明黃芪多糖改善了小鼠的免疫功能。

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