谷子葉片發育過程的基因表達動態分析

王亞敏 ，申慧敏 ，單 萌 ，段萌萌 ，梁雨晴 ，王興春

（1.山西農業大學 生命科學學院，山西太谷 030801；2.山西農業大學 農學院，山西 太谷 030801）

葉片通過光合作用和呼吸作用為植物生長發育提供能量，同時儲存有機物和礦質營養。對大部分作物而言，葉片形態建成、葉片面積、空間分布會影響光合利用率，從而直接或間接影響作物的產量和品質[1]。旗葉是作物重要的光合作用器官，其大小、長寬比、形狀、夾角是決定谷類作物糧食產量潛力的重要組成部分[2]。中國水稻研究所的高振宇團隊分析了水稻兩優培9 核心重組自交系的旗葉長、寬和長寬比與單株產量的相關性，發現旗葉的大小和形狀與單株產量之間存在顯著的相關性[3]。

而葉片發育是一個極其復雜的調控過程，有很多轉錄因子參與其中，如KNOX 家族、NAC 家族和WOX 家族。KNOX 轉錄因子在葉片發育過程中發揮關鍵作用[4-5]，分為Ⅰ、Ⅱ、M 類。其中，M 類KNOX基因促進葉片邊緣分化，而Ⅱ類起相反作用，抑制葉邊緣鋸齒化[6]。NAC 家族中CUC2基因通過激活植物生長素來促進早期葉片發育中鋸齒的出現，而CUC3在后期維持鋸齒的生長[7]。WOX 家族中AtWOX1和AtPRS/WOX3基因是擬南芥簡單葉片橫向生長的主調節因子[8]；少數雙子葉植物中WOX1同源物突變導致葉片擴張減弱，從而使葉片變窄[9-10]；在番茄（Solanum lycopersicon）中，包括SLMP、SLARF19A和SLARF19B在內的幾種生長素反應因子都可以促進葉片的萌發和生長[11]。

近年來，RNA-Seq 技術已經應用于葉片發育相關研究，并取得了豐碩成果[12-13]。在番茄中，通過轉錄組測序初步探明了GT-2 亞家族SlGTL5基因調控葉片變小的分子機理[14]；在玉米中，通過轉錄組測序明確了一些與玉米葉片發育密切相關的代謝路徑，發現了植物激素間的動態平衡對葉片發育的重要影響[15]。谷子（Setaria italicaL.）是我國的原產作物和北方旱作生態農業的主栽作物，由于其具有抗旱、耐瘠薄、高光效和基因組較小等特點，已經成為C4禾谷類研究的理想模式植物[16]。

本研究利用RNA-Seq 技術分析了幼嫩葉片、成熟葉片、旗葉和開始衰老的葉片等4 個不同發育時期谷子葉片中基因表達情況，旨在為揭示作物葉片發育調控的分子機制和葉片發育的調控網絡奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料為山西農業大學雜糧分子育種團隊創制的超早熟迷你模式谷子xiaomi，其生育期65 d 左右，其株高僅為40～50 cm，這些特征使得其成為谷子葉片發育的理想材料[17]。xiaomi種植于山西省晉中市太谷區試驗田內（37°25′13″N，112°35′26″E）。分別取發芽后2 周齡幼苗頂部第1 片完全伸展的葉子（幼嫩葉片，Leaf1）、30 d（約抽穗前10 d）幼苗植株頂部第2 片葉子（成熟葉片，Leaf2）、灌漿期旗葉（旗葉，Leaf3）和灌漿期頂部第4 片葉子（開始衰老葉片，Leaf4）。每個樣品至少隨機選擇5 株健康的xiaomi植株，每個時期3 次生物學重復。葉片取樣后立即置于液氮速凍，然后保存于-80 ℃冰箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉片總RNA 的提取、cDNA 文庫的構建及測序 采用天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure 試劑盒（#DP441）提取谷子葉片總RNA，檢測合格后用于后續RNA-Seq 文庫構建。文庫構建采用NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina（#E7770，New England BioLabs）進行。構建的測序文庫由北京百邁克生物科技有限公司使用Illumina HiSeq X-ten 平臺進行測序。

1.2.2 實時熒光定量PCR 驗證差異表達基因 利用實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）驗證差異表達基因。RT-qPCR 及基因表達量的計算按照申慧敏等[18]的方法進行。RTqPCR 所用的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如表1 所示。

1.3 差異表達基因、GO 和KEGG 通路富集分析

首先，利用Trimmomatic v.0.38 軟件對原始測序數據（raw reads）進行過濾，參數設置為ILLUMINACLIP∶TruSeq3-PE.fa∶2∶30∶10 LEADING∶3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW∶4∶15 MINLEN∶30 HE ADCROP∶10，得到高質量的測序數據（clean reads），利用HISAT2 v.2.04 與xiaomi參考基因組[17]進行比對，參數為默認。然后，利用R 語言計算基因的表達量并篩選差異表達基因。差異表達基因篩選標準為基因表達量差異倍數大于等于2，即|log2fold change|≥1 且Padj≤0.01。最后，將篩選到的差異表達基因進行Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析，Padj＜0.05 的GO或KEGG 為顯著富集的GO 或KEGG。

2 結果與分析

2.1 谷子葉片轉錄組測序及分析

對幼嫩葉片（Leaf1）、成熟葉片（Leaf2）、灌漿期旗葉（Leaf3）和倒四葉（Leaf4）4 個不同發育時期的xiaomi葉長進行統計，得出平均葉長依次為7.9、18.4、26.7、21.5 cm（圖1）。轉錄組測序 共獲得733.43 M干凈讀段，平均每個樣品為61.12 M。與xiaomi參考基因組進行比對分析發現，Leaf1、Leaf2、Leaf3 和Leaf4 各樣品讀數段的匹配率分別為94.63%、90.78%、95.17%和95.17%，平均約有93.94%比對到參考基因組上。有82.46%～93.13%的讀數段比對到參考基因組唯一位置，有2.707%～5.251%的讀數段比對到參考基因組多個位置。比對到參考基因組正鏈和負鏈的比例分別平均為45.20%和45.30%，二者比例相當（表2）。

圖1 4 個發育時期的xiaomi 葉片及葉長統計Fig.1 xiaomi leaves and statistics of leaf length at four developmental stages

表2 測序數據統計Tab.2 Statistical table of sequencing data

2.2 差異基因表達分析

與Leaf1 相比，Leaf2 中表達量上調和下調的基因分別有164、893 個；Leaf3 中表達量上調和下調的基因分別有406、1 627 個；Leaf4 中表達量上調和下調的基因分別有556、1 732 個（圖2）。與Leaf1 相比，Leaf3 和Leaf4 中錨定蛋白基因、抽穗開花基因、NAC 轉錄因子、過氧化氫同工酶基因等表達上調；而富含脯氨酸的蛋白、蛋白app1 和胚蛋白等表達下調（表3）。這3 組共有的差異表達基因有451 個，特有的差異表達基因分別有531、180、408個（圖3-A）。

表3 谷子葉片發育過程中的差異表達基因Tab.3 Differentially expressed genes during leaf development in foxtail millet

與Leaf3 相比，Leaf2 中表達量上調和下調的基因分別有1 078、1 235 個；Leaf4 中表達量上調和下調的基因分別有12、8 個（圖2）。Leaf1 vs Leaf3、Leaf2 vs Leaf3 和Leaf3 vs Leaf4 這3 組共有的差異表達基因3個，分別為Si5g44570、Si1g04990和Si2g22360，特有的差異表達基因分別有1 067、1 345、15 個（圖3-B）。

圖2 谷子葉片發育過程基因表達分析Fig.2 Analysis of gene expression during leaf development in foxtail millet

Leaf2 與Leaf4 相比，表達量上調和下調的基因分別有1 176、1 381 個（圖2）。Leaf1 vs Leaf4、Leaf2 vs Leaf4 和Leaf3 vs Leaf4 這3 組共有的差異表達基因有6個，分別為Si5g38341、Si8g19630、Si3g15250、Si1g04990、Si8g20630和Si8g17760，特有的差異表達基因分別有1 140、1 406、5個（圖3-C）。

圖3 不同葉片發育階段差異表達基因的維恩圖Fig.3 Venn diagram of differentially expressed genes at different leaf development stages

將Leaf1 vs Leaf2、Leaf2 vs Leaf3 和Leaf3 vs Leaf4 這3 組差異基因進行比較發現，它們共有的差異表達基因僅有1 個，為Si8g11970，編碼脫水素DHN1；特有的差異表達基因分別有666、1 920、13 個（圖3-D）。從Leaf1 vs Leaf2 中發現，編碼光系統Ⅰ反應中心亞單位N（Si7g28460）、谷胱甘肽轉移酶GST 23（Si8g01840）、E3泛素連接酶RHA2A（Si7g03580）和RUP1 蛋白（Si1g12060）等基因差異表達。從Leaf2 vs Leaf3 中發現編碼MADS-box 蛋白（Si2g01630）、玉米醇溶蛋白（Si9g29850）、生長素反應蛋白IAA（Si3g17190）和異淀粉酶（Si6g21130）等基因差異表達。從Leaf3 vs Leaf4 中發現，編碼精氨酸脫羧酶（Si1g25160）、漆酶（Si8g20630）和莖28 ku 糖蛋白（Si3g11260）等基因差異表達（圖3-D）。

對這6 組的差異基因同時進行比較發現，沒有共有的差異基因，Leaf1 vs Leaf2、Leaf1 vs Leaf3、Leaf1 vs Leaf4、Leaf3 vs Leaf2 和Leaf4 vs Leaf2 特有的差異基因分別有188、90、181、172、304 個。Leaf3 vs Leaf4 特有的差異基因有3 個，分別為編碼未知蛋白的基因Si1g29660、編碼漆酶前體蛋白的基因Si3g29150和編碼未知蛋白的基因Si9g50150（圖3-E）。

可以直觀地看出，Leaf2～Leaf4 較Leaf1 的下調基因數遠高于上調基因數，Leaf3～Leaf4 較Leaf2 的上調基因數高于下調基因數，Leaf4 較Leaf3 上調基因數高于下調基因數，具體原因還有待進一步研究。由于Leaf3 和Leaf4 都屬于灌漿期的葉片，所以二者的差異基因數最少。

進一步研究發現，抽穗開花關鍵調控因子Hd3a（Si4g07330）在灌漿期Leaf3 和Leaf4 中高表達（表3）。植物激素在葉片發育中也起到重要作用，赤霉素2-β 加氧酶基因（Si3g14770）在Leaf2、Leaf3 和Leaf4 中的表達量都顯著升高；順式玉米素O-葡糖基轉移酶基因（Si7g20750）在灌漿期Leaf3和Leaf4 表達量升高。

2.3 谷子葉片發育相關差異表達基因KEGG 通路分析

為進一步分析上述差異表達基因參與的代謝通路，對Leaf1、Leaf2、Leaf3 和Leaf4 不同時期葉片之間的差異表達基因進行了KEGG 分析，結果表明，Leaf1 vs Leaf2、Leaf1 vs Leaf3、Leaf1 vs Leaf4、Leaf3 vs Leaf2、Leaf3 vs Leaf4 和Leaf4 vs Leaf2 這6 個組間的差異基因分別被注釋到15、54、56、58、2、56 條KEGG 代謝通路中。其中，光合作用-天線蛋白、苯丙素類化合物生物合成、玉米素生物合成、次生代謝物的生物合成等富集程度較高（表4）。

表4 差異表達基因KEGG 富集條目Tab.4 KEGG enrichment items of differentially expressed genes

2.4 谷子葉片發育相關差異表達基因GO 富集分析

對Leaf1、Leaf2、Leaf3、Leaf4 等4 個不同發育時期葉片之間的差異表達基因進行GO 富集分析，結果如圖4 所示。

圖4 谷子葉片發育過程中差異表達基因的GO 富集條目Fig.4 GO enrichment items of differentially expressed genes in foxtail millet during leaf development

圖4 結果表明，Leaf1 vs Leaf2 的差異表達基因被富集到2 275 個GO 條目中，其中生物過程、分子功能和細胞組分富集的通路分別占65.23%、24.66%和10.11%；Leaf1 vs Leaf3 的差異表達基因被富集到3 197個GO 條目中，其中生物過程、分子功能和細胞組分富集的基因分別占62.46%、29.24%和8.32%；Leaf1 vs Leaf4 的差異表達基因被富集到3 341 個GO 條目中，其中生物過程、分子功能和細胞組分富集的基因分別占62.77%、29.03% 和8.20%。此外，生物過程中有1 268 個GO 條目是以上這3 個比較組間共同富集到的通路，其中NADP代謝通路（GO：0006739）、戊糖磷酸分流（GO：0006098）、對遠紅光的反應（GO：0010218）、光合作用（GO：0015979）等GO 條目富集程度較高；分子功能中有488 個GO 條目是這3 個比較組間共同富集到的通路，其中氧化還原酶活性（GO：0016491）、水解酶活性，水解O-糖基化合物（GO：0004553）、四吡咯結合（GO：0046906）、催化活性（GO：0003824）等GO 條目富集程度較高；細胞組分中有207 個GO 條目是這3 個比較組間共同富集到的通路，其中類囊體（GO：0009579）、質體部分（GO：0044435）、胞外區（GO：0005576）、葉綠體類囊體（GO：0009534）等GO 條目富集程度較高。Leaf3 vs Leaf2 的差異表達基因被富集到3 523 個GO 條目中，其中生物過程、分子功能和細胞組分富集的通路分別有2 196、1 007、320 個。以上4 個比較組的差異表達基因富集的GO 條目遠高于Leaf3 vs Leaf4 和Leaf4 vs Leaf2 這2 個比較 組。

Leaf3 vs Leaf4 和Leaf4 vs Leaf2 的差異 表達基因分別被富集到203、191 個GO 條目中，其中生物過程、分子功能和細胞組分富集的通路分別占59.11%、25.62%和15.76%。此外，生物過程中有112 個GO 條目是Leaf3 vs Leaf1、Leaf3 vs Leaf2、Leaf3 vs Leaf4 這3 個比較組間共同富集到的通路，其中NADP 代謝通路（GO：0006739）、戊糖磷酸分流（GO：0006098）、對遠紅光的反應（GO：0010218）、光合作用（GO：0015979）等GO 條目富集程度較高；分子功能中有47 個GO 條目是這3 個比較組間共同富集到的通路，其中氧化還原酶活性（GO：0016491）、水解酶活性，水解O-糖基化合物（GO：0004553）、四吡咯結合（GO:0046906）、催化活性（GO：0003824）等GO 條目富集程度較高；細胞組分中有32 個GO 條目是這3 個比較組間共同富集到的通路，其中類囊體（GO：0009579）、質體部分（GO：0044435）、胞外區（GO：0005576）、葉綠體類囊體（GO：0009534）等GO 條目富集程度較高（圖4）。Leaf1 vs Leaf2、Leaf3 vs Leaf2 和Leaf3 vs Leaf4 這3 個比較組間沒有共同富集到的GO 通路。

2.5 差異表達基因RT-qPCR 驗證

為了驗證測序結果的可靠性，挑選了4 個與葉片發育有關且在不同時期差異表達量大的基因，進行qRT-PCR 驗證，其中，Si3g04370基因編碼同型半胱氨酸甲基轉移酶樣Ⅱ型蛋白，在Leaf2 中高表達；Si9g22900基因編碼環指和CHY 鋅指結構域蛋白，在Leaf1 和Leaf2 幾乎不表達，在灌漿期葉片中高表達；Si5g16080基因編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶，是植物代謝過程中的關鍵酶[19]；Si6g25180基因編碼質子梯度蛋白，參與細胞的光合作用，在Leaf1和Leaf2 中高表達。qRT-PCR 結果表明，這4 個差異表達基因的上調或下調倍數雖然與測序結果不同，但基因表達的變化趨勢與RNA-Seq 結果一致，且符合葉片不同發育時期的特征（圖5）。

圖5 谷子葉片發育過程基因表達分析Fig.5 Gene expression analysis during leaf development in foxtail millet

3 結論與討論

葉片是作物最主要的光合作用器官，不同發育階段的葉片對光信號的反應是不同的。光不僅可以為光合作用提供能量，還能作為重要的信號因子調控植物生長發育。研究發現，在光受體下游，光信號經復雜的信號轉導網絡以及全基因組表達變化來指導植物的生長發育，使得植物能夠適應周圍的光照環境。紫外光B 波段（UV-B）光受體UVR8（UV Resistance Locus 8）接收到UV-B 光后將信號向下游傳遞，通過調控蛋白COP1（Constitutively Photomorphogenic 1）、調控蛋白RUP1/2（Repressor of UV-B Photomorphogenesis 1/2）和轉錄因子HY5（Elongated Hypocotyl 5）等核心信號因子將光信號傳遞到UV-B 光應答基因，啟動植物對UV-B光信號的響應[19]。其中RUP1/2 與E3 泛素連接酶相互作用抑制紫外光信號通路。隨著葉齡的生長，光合作用強度先上升后降低。其中，COP1 是正調節因子，RUP1 為負調控因子[20]。本研究發現，編碼RUP1 蛋白的基因Si1g12060和編碼E3 泛素連接酶RHA2A 的基因Si7g03580在幼嫩葉片Leaf1 中表達量高，抑制了幼嫩葉片的光合作用，而它們在Leaf2、Leaf3 和Leaf4 中表達量顯著降低，對光信號的抑制作用也隨之減弱，光合作用增強。而編碼紫外光B 受體UVR8 的基因Si5g38090和COP1 基因Si1g33840在Leaf2 中表達量顯著高于其他發育期葉片。S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因可調控谷子旗葉及鄰近葉葉綠素合成，影響光合作用，同時參與了乙烯介導的葉片早衰[21]。本試驗發現，編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因Si5g16080在Leaf2 中高表達，Leaf2 為緊挨旗葉下面的成熟葉片，該時期光合作用最強，受到該基因調控，同時該基因在快衰老的葉片Leaf4 中表達較高。在不同發育階段，植物對光線強度的要求是不一樣的。Si6g25180編碼質子梯度蛋白，與擬南芥PGR5 蛋白同源，參與對紅光、藍光、蔗糖的反應和光系統Ⅰ的光合電子傳遞過程，Leaf1 和Leaf2 處于光形態建成階段，該基因表達量較高。

作物谷穗開花后開始灌漿，灌漿期又稱籽粒形成時期，是決定作物產量的關鍵時期，是谷穗干物質積累的關鍵時期，是種子發育成熟的關鍵時期。該時期籽粒淀粉、蔗糖、蛋白質含量顯著增加。大豆MADS-box 基因GmAGL15在開花15 d 后表達量升高，在種子發育過程中起調控作用[22]。本研究發現，谷子MADS-box 基因Si2g01630在灌漿期Leaf3 和Leaf4 中表達量顯著升高。華中農業大學玉米團隊克隆了一個編碼gar2 相關的核仁蛋白的基因GAR2，可調控玉米籽粒的含水量[23]。本研究中，Si9g43690編 碼GAR2 蛋 白，在Leaf1 和Leaf2時期，谷子還未抽穗，灌漿期籽粒開始乳熟，GAR2開始發揮作用，在Leaf3 和Leaf4 中高表達。擬南芥葉片衰老的正調節因子WRKY75 的沉默或敲除延遲了葉片衰老，而WRKY75 的過表達加速了葉片衰老[24]。本研究中，WRKY75 轉錄因子Si8g12750在Leaf4 中表達量顯著升高。

通過對谷子xiaomi幼嫩葉、成熟葉、灌漿期旗葉、倒四葉共4 個時期的葉片轉錄組數據分析，發現谷子葉片發育是一個極其復雜的過程，受到眾多基因的調控。谷子2 周齡幼苗期、抽穗前10 d 和灌漿期的基因表達動態圖譜為后續篩選和鑒定葉片發育關鍵基因提供了參考。未來可以利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術在xiaomi中研究這些基因的功能，深入揭示葉片發育調控的分子機制，為優質高產作物新品種的培育提供理論指導。