胃癌中FKBP5的表達及其與免疫浸潤和預后相關性研究

劉偉強，符 洋

(鄭州大學第一附屬醫院胃腸外科，河南 鄭州 450052)

胃癌是全世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，也是最常見的惡性腫瘤死亡原因之一[1]。有研究報道胃癌發病率居我國惡性腫瘤第2位，死亡率居我國惡性腫瘤第3位。該病的主要危險因素包括幽門螺桿菌感染、年齡、高鹽攝入量以及水果和蔬菜含量低的飲食[2]。盡管近些年靶向治療對惡性腫瘤生物學和發展的理解方面取得了進展，但胃癌的治療效果有限，患者的預后仍然較差。急需有效的生物標志物和治療的靶點[3-4]。因此，進一步探索研究新的基因功能改變與胃癌發生、發展及其惡性特征的關系，對揭示其發生、發展的精確分子機制、設計合理的治療藥物及判斷預后，進一步提高我國胃癌的治療水平具有重要意義。

FKBP家族基因因其能夠于FK506或雷帕霉素結合發揮免疫抑制作用而得名，是進化保守的親免素家族的重要成員，在哺乳動物中普遍表達[5-6]。FKBP家族基因都含有一個或多個PPIase結構域，在生理或者病理情況下參與多種生物學過程，包括蛋白折疊、轉錄后調控、炎癥反應、免疫應答、受體信號通路等[6-7]。近年來越來越的的證據表明FKBP 家族基因在惡性腫瘤的發生發展中起到不可忽視的作用[8-9]。FKBP5作為FKBP家族基因的一員，其在胃癌中的表達及臨床意義尚不明確，本研究旨在分析FKBP5在胃癌中的表達，并利用生物信息學方法分析FKBP5與免疫浸潤及患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1 數據來源從UCSC Xena(http://xena.ucsc.edu/)網站下載人類腫瘤基因組圖譜數據庫(TCGA)中的包含完整預后信息的胃癌組織(408例)和癌旁正常組織樣本(35例)的RNA表達數據并與臨床信息(包括總生存時間、生存狀態、T分期、病理分級等)進行匹配，預后信息及相關臨床缺失的樣本予以剔除。

1.2 TIMER數據庫使用TIMER 2.0數據庫中的檢索功能評估FKBP5在TCGA不同腫瘤中的mRNA水平的表達情況;利用TIMER數據庫評估胃癌中FKBP5 mRNA表達與6種免疫細胞浸潤的相關性，計算出Spearman秩相關系數和P值并繪制散點圖。根據免疫細胞浸潤水平中位數將樣本分為高、低組，應用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，log rank檢驗其對胃癌患者預后的影響。

1.3 GSEA分析從分子特征數據庫(MSigDB)中下載 hallmark基因集(h.all.v7.2.symbols.gmt)和ontology基因集(c5.all.v7.4.symbols.gmt)，使用clusterprofiler按照默認參數進行GSEA分析高、低表達FKBP5組的富集通路，計算出富集分數(ES)、P值和錯誤發現率(FDR)，分析FKBP5潛在作用機制。FDRP<0.05定義為差異有統計學意義。使用gseaplot2繪制富集圖。

1.4 KM plotter數據庫使用KM plotter在線網站檢索在GSE62254數據集283例帶有完整預后信息的樣本，按照FKBP5表達中位數將樣本分為FKBP5高表達和低表達組，Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，log rank檢驗其對胃癌患者預后的影響。根據分期篩選出Ⅱ期和Ⅲ期的樣本，并在亞組中分析FKBP5對患者預后的影響。

1.5 免疫檢查點基因相關性分析在TCGA胃癌數據集中，利用Pearson相關分析FKBP5與免疫檢查點基因的表達相關性，其中P<0.05被認為差異有統計學意義。利用corrplot程序包繪制相關性熱圖，ggplot2繪制相關性散點圖。

1.6 統計學處理采用R-4.0.3進行本研究的統計分析及作圖。2組之間的差異分析使用Wilcoxon-Mann-WhitneyU檢驗，2組以上采用Kruskal-WallisH檢驗。在TCGA胃癌數據集中以FKBP5表達中位數分組用Kaplan-Meier法繪制生存曲線評估FKBP5高、低表達對患者總生存時間的影響，log rank檢驗進行統計學。limma程序包用來分析FKBP5高、低表達組樣本的差異基因。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 FKBP5在泛癌中表達利用TIMER數據庫檢索FKBP5在TCGA數據庫33種腫瘤樣本的轉錄水平的表達，FKBP5在多形性膠質母細胞瘤、肝癌組織中表達上調，而在膽囊癌、乳腺癌、結腸癌、甲狀腺癌、胃癌等癌組織中的表達低于癌旁組織(P<0.05)。見圖1。

圖1 FKBP5在33種人類腫瘤組織中的表達(1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001)

2.2 FKBP5在胃癌中表達進一步我們分析了FKBP5在胃癌不同亞組中的表達，發現FKBP5在腫瘤組織中表達下調，進一步我們分析FKBP5在不同組織學亞組中的表達差異。發現在較高的病理分級(G3)中FKBP5表達較高，FKBP5的表達隨著T分期的增加而增高(P<0.05)。見圖2。

圖2 FKBP5在不同胃組織中的表達(1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001)

2.3 FKBP5的表達與胃癌患者的預后相關在TCGA胃癌數據集中，將不同樣本中FKBP5的表達按照中位數分為高表達和低表達2組，然后利用Kaplan-Meier繪制生存曲線，log rank 檢驗比較2組生存曲線的P值，FKBP5高表達組患者總生存率較差(P<0.05)。就不同分期而言，在Ⅱ期胃癌患者中FKBP5高表達與較差的預后相關，而在Ⅲ期胃癌中FKBP5 高表達的患者預后較差，雖然P>0.05，但2組之間的差異有一定趨勢。然后我們利用KM plotter 網站檢索在GSE62254數據集中進一步驗證FKBP5表達對胃癌患者預后的影響，發現FKBP5高表達患者無論是在總體樣本中還是在Ⅱ期或者Ⅲ期患者中均表現出較差的預后(HR>1.50,P<0.05)。見圖3。

2.4 FKBP5在胃癌中富集通路分析在TCGA胃癌數據集中，分析FKBP5高、低表達2組的差異基因，將基因按照差異倍數(Log2FC)從高到低排序，利用GSEA分析，以GO基因集分析顯示FKBP5高表達組富集的前5個基因集為吞噬識別、免疫球蛋白復合物、免疫球蛋白復合物循環、T細胞受體復合物、免疫球蛋白受體結合。以Hallmark基因集分析顯示FKBP5高表達組與同種異體排斥、上皮間質轉化、HEDGEHO信號、炎癥反應、肌生成等信號通路相關(ES>1.50,P<0.05)。這些結果提示FKBP5在胃癌中的潛在作用機制。見圖4。

圖4 GSEA分析FKBP5在胃癌中富集通路分析

2.5 FKBP5與腫瘤免疫細胞浸潤相關通過TIMER數據庫分析FKBP5轉錄水平與胃癌中B細胞、CD4 T細胞、CD8 T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞6種免疫細胞浸潤水平的相關性。發現FKBP5與CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞的浸潤呈正相關(cor>0.35,P<0.05)，與腫瘤純度呈負相關，與B細胞浸潤水平無明顯相關性(P>0.05)。在TCGA胃癌樣本中，利用免疫浸潤水平中位數分組，生存分析發現高巨噬細胞浸潤與較差的預后相關(P<0.05),而其他幾種免疫細胞浸潤水平與患者預后無明顯相關性。見圖5。

圖5 FKBP5在胃癌中免疫浸潤的關系

2.6 FKBP5的表達與免疫檢查點基因正相關利用Pearson相關分析評估FKBP5轉錄水平表達與一些經典的免疫檢查點基因的相關性并繪制熱圖。FKBP5與大部分免疫檢查點基因存在正相關(cor>0.45,P<0.05)；散點圖顯示FKBP5與PDCD1(cor=0.43，P<0.05)、PDCD1LG2(cor=0.56，P<0.05)明顯正相關。見圖6。

圖6 FKBP5與免疫檢查點基因的相關性

3 討論

胃癌是一種發病率和死亡率都很高的惡性腫瘤。目前的分子檢測學數據表明，胃癌并不是一個單一的、均質化的實體腫瘤，而是由具有不同生物學特性的幾種胃癌分子亞型組成。比較經典的分型標準是1965年確立的Lauren分型，根據胃癌的組織結構和生物學行為分為：腸型和彌漫性[10]。而后隨著測序技術和高通量數據分析技術的發展，有機會從分子水平進一步探究胃癌發生發展的機制。TCGA團隊依據高質量、大規模的測序數據將胃癌分為：EBV病毒陽型、微衛星不穩定型、基因組穩定型、染色體不穩定型4種分子亞型[11]。與傳統的組織學分型相比，分子分型在患者預后預測、個體化治療方案確定、療效評估等方面更具臨床影響力。但是目前并沒有一些針對胃癌的特異性分子被應用于臨床。因此挖掘新的、有效的分子標志物對胃癌的診斷、預后評估及治療具有重要意義。

FKBP5是一種編碼蛋白質的基因，作為進化保守的親免素家族的一員，其蛋白序列中含有兩個PPIase結構域和3個重復的TPR結構域，這些結構域對于其行使功能具有重要作用[12]。例如，FKBP5通過與熱休克蛋白Hsp90/Hsp70結合成復合體進而調節糖皮質激素受體功能[13]。既往研究[14-15]表明，FKBP5的表達失調或表觀遺傳學的改變會導致炎癥、心血管疾病、精神疾病的發生、發展。近年來越來越的研究[16-18]發現FKBP5的失調與甲狀腺癌、惡性膠質瘤、黑色素瘤等的發生和生存預后顯著相關。

本研究利用生物信息學發現FKBP5在多種腫瘤組織中的普遍失調，其中在胃癌腫瘤組織中下調，同時FKBP5 在不同T分期和組織學分級中的表達也存在異質性，FKBP5在高T分期(T4、T3)中的表達更高，在高組織學分級(G3)中表達更高，這些結果表明FKBP5 可能在胃癌的發生、發展中起到重要作用。同時我們分別在TCGA的測序數據和GSE62254芯片數據中發現FKBP5高表達的患者總生存時間更短，預后更差，且這種差異獨立于不同的病理分期。表明FKBP5有望成為胃癌潛在的生物標志物及治療靶點。GSEA富集分析發現FKBP5主要與同種異體排斥、上皮間質轉化、HEDGEHO 信號、炎癥反應等通路相關。上皮間質轉化是指上皮細胞與其周圍的細胞分離并獲得間質遷移特性的過程。目前普遍認為上皮間質轉化在惡性腫瘤遷移、侵襲和遠處轉移的具有重要作用[19]。因此，我們推測FKBP5可能通過激活上皮間質轉化、炎癥反應等信號促進胃癌的侵襲和轉移，但其潛在機制仍需要深入研究。

腫瘤微環境由各種免疫細胞、炎癥細胞、間質細胞、血管、淋巴管及細胞外基質組成[20]。近年來靶向腫瘤微環境的研究成為熱點。腫瘤中不同比例的免疫細胞能夠與腫瘤細胞相互作用，從而發揮抗腫瘤或者促進腫瘤發生發展的作用。作為腫瘤中免疫浸潤細胞的組成部分，巨噬細胞在腫瘤的發生、發展及免疫治療耐藥等方面具有重要作用。例如，M2巨噬細胞受到Th2細胞因子激活并表現出促進組織重塑和腫瘤進展的功能[21]。本研究的數據表明，在胃癌中微環境中巨噬細胞比例增多與不良預后明顯相關，相關性分析顯示FKBP5 mRNA的表達與巨噬細胞浸潤、CD4+ T細胞浸潤、中性粒細胞浸潤、樹突狀細胞浸潤明顯正相關，提示FKBP5可能參與免疫微環境的調節。有研究[22]發現FKBP51s可以作為黑色素瘤患者免疫治療效果的預測因子。D’Arrigo等[23]發現FKBP51s通過催化隨后糖基化所需的蛋白質折疊上調質膜上的PD-L1表達。因此我們進一步分析FKBP5的表達與一些公認的免疫檢查點基因的表達的相關性，發現FKBP5與這些免疫相關基因明顯正相關。目前以程序性死亡受體1、PD-L1為靶點的藥物已經被批準用于部分腫瘤的免疫治療。我們的數據表明FKBP5可能參與胃癌中的免疫調節，從而促進腫瘤的進展及免疫逃逸，因此靶向FKBP5可能通過調節免疫微環境，從而提高免疫治療效果。

綜上所述，本研究利用生物信息學方法系統的發現FKBP5在胃癌較高的病理分級和T分期中表達較高，且高表達與預后不良相關。FKBP5高表達與巨噬細胞等免疫浸潤水平正相關，同時參與上皮間質轉化等致癌相關通路,有望成為胃癌預后生物標志物和治療的新靶點。