耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌對多黏菌素B體外敏感性檢測方法的差異性研究

裘雪丹 李情操,* 吳巧萍 易澤源

(1 寧波大學醫學院，寧波 315040；2 寧波市醫療中心李惠利醫院，寧波 315040)

肺炎克雷伯菌為條件致病菌，常寄居于腸道和上呼吸道，是醫院感染的重要致病菌之一，近年來碳青霉烯類抗生素大量使用，使得耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae, CRKP)比例逐年增加，CRKP已經成為臨床嚴重感染主要原因之一，其可選擇的抗菌藥物有限，致病性強，可導致肺部感染、泌尿道感染、血流感染和化膿性腦膜炎等疾病，其中由CRKP引起的血流感染的病死率可高達50%～70%[1]，給臨床用藥和治療帶來了極大的挑戰[2-3]。臨床上CRKP對常用的抗生素如β-內酰胺類、四環素類等敏感性下降，而對多黏菌素有較高的敏感性[4]。目前實驗室檢測多黏菌素B的方法主要有微量肉湯稀釋法、儀器法、E-test法和紙片法。肉湯稀釋法作為參考方法，操作復雜，不適合批量檢測；儀器法操作簡單，目前已在實驗室大量開展；E-test法成本較高，紙片法成本低，但均易受MH瓊脂和紙片廠家影響，同時目前尚無關于肺炎克雷伯菌對多黏菌素B的K-B法直徑折點判斷標準。文本主要研究不同方法檢測在CRKP對多黏菌素B體外藥敏檢測中存在的差異，同時建立K-B法直徑和MIC值的回歸方程，為臨床治療和實驗室檢測提供依據。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

選擇2018年1月—2020年6月份寧波地區多中心醫院臨床非重復分離的CRKP菌株147株，作為實驗菌株，其標本來源包括痰液、血液、引流液、創面分泌物和中段尿等。本次研究用菌株經肉湯稀釋法作碳青霉烯耐藥確認。本次實驗藥敏檢測質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853，購自衛生部臨檢中心。

1.2 儀器和試劑

選擇法國梅里埃公司VITEK 2全自動細菌鑒定藥敏儀和中國定制藥敏卡N335，紙片擴散法(K-B)藥敏檢測紙片多黏菌素B(100/10μg/片)選自英國Oxiod公司，肉湯稀釋法和E-test法藥敏試劑選自溫州康泰公司，分離培養基哥倫比亞血瓊脂平板和藥敏培養基MH瓊脂平板均為法國生物梅里埃公司生產。

1.3 方法

1.3.1 儀器法

菌種的鑒定和藥敏按照VITEK 2型全自動微生物分析儀標準操作指南，先挑取待鑒定實驗菌株單個菌落，使用含4.5% NaCl的無菌水調制菌液至1.5×108CFU/mL，使用VITEK 2配套的細菌鑒定卡片GN、藥敏卡N335進行菌種鑒定和藥敏檢測。

1.3.2 肉湯稀釋法

挑取待鑒定實驗菌株單個菌落用無菌水調制至1.5×108CFU/mL，吸取上述調好的菌落加入液體藥敏試驗培養基中，菌液比例為1:200(如2 mL的培養基，加10 μL的菌液)，充分混勻后每孔加100 μL。35℃培養箱隔夜培養16～20 h后取出進行結果判讀。孔內培養液澄清表示不生長；反之，培養液變渾濁或顯色則表示生長。不生長孔為最低抑菌濃度(MIC)。如出現跳孔現象，排除污染情況下以最后一孔為準。CRKP對多黏菌素B的MIC折點按照2020年CLSI判斷標準為2～4 μg/mL。

1.3.3 E-test紙片法

用無菌棉簽取1.5×108CFU/mL菌懸液，于M-H培養基上均勻涂布，將紙片垂直插入培養基，插入后不再轉移。35℃培養箱隔夜培養16～20 h后取出進行結果判讀。培養基表面水滴狀抑菌圈環尖所指向的濃度值即為檢測菌的最低抑菌濃度(MIC)。抑菌圈環尖指向兩個齒輪之間或環尖指向有高低差時取較大的值。

1.3.4 K-B法

用無菌棉簽取1.5×108CFU/mL菌懸液，于M-H培養基上均勻涂布，貼好藥敏紙片35℃培養箱隔夜培養18～24 h后，量取紙片抑菌環直徑。采用大腸埃希菌 ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853對M-H培養基與藥敏紙片進行質控監測，檢測結果均在控。

1.3.5 藥敏結果分析

以標準方法肉湯稀釋法檢測結果為參考：①基本一致率(EA)：兩種方法檢測的MIC值相同或相差±1個稀釋度；②標準符合(CA)：按照相同折點標準，敏感、中介、耐藥一致的菌株百分比；③嚴重錯誤(VME)：參考方法藥敏結果為R，而被評估方法結果為S，即“假敏感”；④重大錯誤(ME)：參考方法藥敏結果為S，而被評估方法結果為R，即“假耐藥”；⑤小錯誤(mE)：參考方法結果為I，而被評估方法藥敏結果為S或R。按照CLSI文件要求，可接受的誤差范圍為：EA和CA≥90%，VME≤1.5%，ME≤3%，mE≤10%[5]。

1.4 統計學處理

應用WHONET5.6軟件和SPSS 18.0統計軟件對臨床菌株的數據資料進行統計分析，兩種方法檢測MIC值比較使用wilcoxon符號秩和檢驗；兩種方法檢測抗菌藥物敏感性的比較使用卡方檢驗，P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 肉湯稀釋法、E-test法和儀器法檢測多黏菌素B藥敏結果

肉湯稀釋法、E-test法和儀器法檢測CRCP對多黏菌素B累計敏感率分別為97.3%、99.3%和98%。肉湯稀釋法和E-test法檢測CRCP對多黏菌素B MIC50和MIC90均為1 μg/mL，儀器法的MIC50和MIC90較微量肉湯稀釋法均低1個稀釋度(0.5μg/mL)(表1和圖1)。

表1 對CRKP的3種MIC檢測方法的結果分布(株)、累積率(%)及MIC50、MIC90值(μg/mL)Tab.1 Results distribution, cumulative rate (%) and MIC50,MIC90(μg/mL) by three testing methods of MIC for CRKP

2.2 肉湯稀釋法、E-test法和儀器法檢測多黏菌素B藥敏結果敏感性比較

微量肉湯稀釋法、E-test法和儀器法檢測多黏菌素B的敏感率分別為97.3%、99.3%和98.0%。卡方檢驗結果P1、P2均大于0.05，顯示儀器法、E-test法與肉湯稀釋法相比敏感性無差異(表2)。

表2 對CRKP的3種MIC檢測方法的敏感性結果比較 [n(%)]Tab.2 Comparison of sensitivity results by three testing methods of MIC for CRKP[n(%)]

2.3 肉湯稀釋法、E-test法和儀器法檢測多黏菌素B MIC值結果比較

肉湯稀釋法、E-test法、儀器法的MIC值分別為(1.39±0.27)μg/mL、(1.02±0.06)μg/mL、(0.82±0.16)μg/mL。儀器法檢測CRKP對多黏菌素B的MIC值明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.01)(表3)。

表3 對CRKP的3種MIC檢測方法的MIC值結果比較(x_±s)Tab.3 Comparison of the MIC values by three testing methods of MIC for CRKP(x_±s)

2.4 E-test法和儀器法與肉湯稀釋法檢測多黏菌素B敏感性的方法學誤差比較

以肉湯稀釋法作為參考方法，按照FDA判斷標準，E-test法和儀器法的EA率為93.2%和95.2%，CA率分別為98.0%和99.3%，VME率分別為2.0%和0.7%；ME率和mE率均為0(表4)。

表4 E-test法和儀器法與肉湯稀釋法檢測多黏菌素B敏感性的方法學誤差比較(%)Tab.4 Incidence of errors between E-test method、instrument method and broth microdilution(%)

2.5 紙片法抑菌環直徑結果與肉湯稀釋法MIC結果回歸統計比較

KB法抑菌圈直徑和肉湯稀釋法KB值與肉湯稀釋法MIC值之間方差分析P＞0.05，故提示KB值與MIC值不存在線性關系(表5和圖2)。

表5 紙片法抑菌環直徑結果與肉湯稀釋法MIC檢測多黏菌素B藥敏結果回歸方程Tab.5 Regression equation between the results of the KB value and the MIC value of polymyxin

3 討論

近年來碳青霉烯類抗生素大量使用，使得耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)比例逐年增加，CRKP已經成為臨床嚴重感染主要原因之一。CRKP耐藥性的獲得途徑有產碳青霉烯酶和外膜蛋白的缺失，膜通透性改變以及外排泵過表達等，這給臨床的抗感染治療帶來了巨大的難題[6]。多黏菌素B是一種多肽類抗生素，有其獨特的化學結構和作用機制，并擁有高效抗菌活性，已經成為治療CRKP的重要選擇[7]。目前實驗室檢測多黏菌素B的方法主要有微量肉湯稀釋法、儀器法、E-test法。不同的藥敏檢測方法各有優缺點，本文主要采用上述4種方法檢測多黏菌素B對寧波地區多中心醫院臨床非重復分離的CRKP的體外敏感性的差異性進行分析討論，為臨床治療和實驗室檢測提供依據。

不合理的用藥使得多黏菌素耐藥菌株也不斷出現[8]，微量肉湯稀釋法能夠經濟有效準確的檢測出病原菌的最低抑菌濃度，是藥敏試驗的參考方法。本研究中微量稀釋法結果顯示，多黏菌素B對CRKP具有較高的抗菌活性，這與其他學者的研究[9-10]結果一致。E-test法和儀器法其累積敏感率均較高，與微量稀釋法結果較一致，有較高的可靠性，但在出現有疑問的藥敏結果或結果不相符合時，應盡量采用微量肉湯稀釋法復核。

準確的MIC值對于臨床抗生素敏感性指導治療更有意義[11]。肉湯稀釋法雖為參考方法，結果準確但操作復雜且成本較高，不適合臨床實驗室大量開展[12]。因此替代方法的準確性尤為重要。本實驗采用的是插入式E-test試紙條，不會產生氣泡等干擾因素，讀取結果更簡便[13]，以微量肉湯稀釋法MIC值作為參考方法進行比較，E-test法檢測CRKP對多黏菌素B的MIC值無明顯差異，故臨床實驗室可采用E-test法對多黏菌素B進行常規的敏感性檢測。儀器法檢測CRKP對多黏菌素B的MIC值顯著降低，這與335藥敏卡其他抗菌藥物報道類似[14]，所以此種方法報告的敏感結果應謹慎，必要時進行相關驗證和復核。

與肉湯稀釋法相比，E-test法和儀器法的EA和CA均＞90%，高于CLSI參考標準，無Me和me，但均存在VME，E-test法的VME＞1.5%，高于參考標準，其原因易受多種因素影響，如抗生素含量、其擴散能力、瓊脂厚度和成分以及人工操作可能的誤差，所以實驗人員應嚴格按照SOP規范進行藥敏操作。

目前國內微生物實驗室主要使用儀器法和Etest法來檢測CRKP對多黏菌素B的MIC值，關于肺炎克雷伯菌對多黏菌素B的紙片擴散法的判斷折點CLSI尚無明確。但對于多重耐藥菌株的出現，尤其是CRKP，以多黏菌素B為主的聯合用藥是當下研究的重點[15]，紙片擴散法在聯合藥敏對多重耐藥菌的研究中極其重要。本研究為了明確K-B法檢測效果，采用紙片擴散法對147株CRKP的抑菌圈進行對比研究。與肉湯稀釋法對比發現，對于多黏菌素B耐藥或敏感CRKP菌株，其紙片抑菌圈直徑并沒有出現明顯減小或擴大。究其原因主要是多黏菌素B是多組分結構，分子量較大，故在瓊脂中不易擴散，此外還有其固有的陽離子特性等影響的因素[16]。所以，K-B法作為傳統檢測方法，并不適合于多黏菌素B的敏感性判斷，與參考方法測得MIC值回歸曲線的擬合程度也并不高。本研究受限于本次菌株數量原因，有待進一步的完善。