MALDI-TOF MS在耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌同源性分析的應(yīng)用研究

張杰 張金鑫 楚新旭 應(yīng)沖濤 郭普 汪華學(xué),*

(1 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，蚌埠 233004；2 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院疼痛科，蚌埠 233004；3 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科，蚌埠 233004)

近年來隨著碳青霉烯類藥物的廣泛及不合理應(yīng)用，引起耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)的檢出率不斷增長，為臨床診療帶來了巨大的風(fēng)險與挑戰(zhàn)[1-2]。通過分析CRKP的同源性，便于明確CRKP的流行病學(xué)分布和擴散方式，為臨床感染防控及疾病診療提供依據(jù)。脈沖場凝膠電泳(PFGE)作為現(xiàn)今最常用于鑒定細(xì)菌分型的分子生物學(xué)技術(shù)之一，通過分析菌株間的同源性，能夠有效識別院內(nèi)CRKP引起的感染流行與暴發(fā)規(guī)律，但由于操作復(fù)雜、耗時、實驗條件苛刻等因素制約，常規(guī)醫(yī)療機構(gòu)少有開展[3]。目前MALDI-TOF MS作為快速篩選菌株種屬的新工具，具有高通量、時效高、誤差小、性價比高等優(yōu)勢，為診療提供強大的技術(shù)支撐[4]。MALDI-TOF MS除用于種屬鑒定外，也可用于在同源性的分析比較，通過質(zhì)譜峰進(jìn)行聚類分析便可快速監(jiān)測耐藥菌株的流行病學(xué)分布，為耐藥菌株的院內(nèi)感染控制提供指導(dǎo)意見[5]。本研究應(yīng)用MALDI-TOF MS采集CRKP菌株的質(zhì)譜圖，利用自帶的SARAMIS軟件分析菌株間的同源性，PFGE作為分組標(biāo)準(zhǔn)，旨在評價MALDITOF MS進(jìn)行同源性分析的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

收取某院2018年9月—2020年10月在微生物室分離自痰、血液、尿液及胸水等標(biāo)本的肺炎克雷伯菌295株(除去同一病患相同部位的重復(fù)菌株)，其中分離自痰標(biāo)本130株，血液標(biāo)本62株，尿液標(biāo)本27株，胸水標(biāo)本31株，分泌物標(biāo)本33株，腦脊液標(biāo)本12株?？剖襾碓匆姳?。質(zhì)譜質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC8739；標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705。菌株均保存于-80℃冰箱中。

表1 295株肺炎克雷伯菌的科室來源Tab.1 The department source of 295 Klebsiella pneumoniae strains

1.1.2 儀器與試劑

MALDI-TOF MS、48孔靶板及麥?zhǔn)媳葷醿x購自法國Bio-Merieux公司，PFGE電泳儀及成像儀源自美國Bio-Rad公司；MH平板和哥倫比亞血瓊脂平板購自合肥天達(dá)試劑公司，CHCA基質(zhì)液購自法國Bio-Merieux公司；美羅培南(10 μg)及亞胺培南(10 μg)藥敏卡片購自英國Oxoid公司；蛋白酶K和XbaI內(nèi)切酶購自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)及種屬鑒定

從-80℃冰箱選取保存的菌株，按三區(qū)劃線，接種至哥倫比亞血瓊脂平板上，放在37℃溫箱中過夜培養(yǎng)后，再次分純培養(yǎng)。挑取單一菌落，應(yīng)用甲酸提取法萃取出菌株蛋白，取1 μL上清液滴至48孔靶板上，一菌兩孔，最后挑取ATCC8739單一菌落，均勻涂抹在中間靶孔上，用于圖譜校準(zhǔn)。然后，分別加1 μL CHCA液覆蓋靶孔上，晾干后利用MALDITOF MS自帶的RUO系統(tǒng)，以線性、正離子模式，調(diào)整頻率50 Hz，在質(zhì)荷比2000～20000 Da內(nèi)收集圖譜。將得到的峰度與數(shù)據(jù)庫對比，重新鑒定至種水平。

1.2.2 耐藥表型分析

挑取單個純菌落，應(yīng)用麥?zhǔn)媳葷醿x配至0.5 CFU/mL的菌懸液，接種至MH平板，37℃溫箱中孵養(yǎng)16～18 h，結(jié)果參照2020版CLSI M100 30th藥敏標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，其中美羅培南或亞胺培南的抑菌圈直徑≤19 mm，篩選為CRKP。

1.2.3 PFGE分析

按照文獻(xiàn)[6]方法所述，將篩選出的CRKP菌株，挑取新鮮純菌落至緩沖液中，震蕩搖勻15s，制成4個麥?zhǔn)蠞岫鹊木?，通過裂解、洗膠、酶切、上樣，接著電泳獲得圖像，最后利用BioNumerics軟件分析同源性。結(jié)果根據(jù)文獻(xiàn)[7]判讀：①條帶完全一樣為同一型；②1～3個條帶有差異為同一型的不同亞型，表示高度有關(guān)；③4～6個條帶有差異定為不同型別，表示可能有關(guān)；④≥7個條帶有差異定散發(fā)菌株，表示不相關(guān)。

以PFGE同源性分析作為分組標(biāo)準(zhǔn)：①高度同源組：相似性＞85%；②中度同源組：相似性介于70%～85%；③低度同源組：相似性＜70%。

1.2.4 MALDI-TOF MS分析同源性

參照“1.2.1”方法獲取待分析CRKP的質(zhì)譜圖，取2000～20000質(zhì)荷比為分析區(qū)間，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SARAMIS軟件中，應(yīng)用Taxonomy工具中的相似性分型和identical mass分型進(jìn)行圖譜的分析比較。

2 結(jié)果

2.1 PFGE結(jié)果

經(jīng)耐藥表型共篩選出55株CRKP；PFGE對其進(jìn)行聚類分析，得出同源性分析樹狀圖(圖1)，PFGE的分型、檢出結(jié)果及菌株來源見表2。

表2 PFGE的分型、檢出結(jié)果及菌株來源Tab.2 Classification, detection results and source of PFGE

2.2 3組分析比較

2.2.1 高度同源組

本組大多數(shù)KPN菌株同源性高度集中，根據(jù)PFGE結(jié)果，相似性均＞85%(圖1)；采用SARAMIS軟件的identical mass分型(圖2A)，菌株大多集中分布于60%～80%，均屬于A型，且A1型identical mass部分高于80%(HF516、HF518、BY261、BY281),其中發(fā)現(xiàn)HF1676與同型KPN相比，在identical mass分型中差異性較大，對高度同源組造成了一定的影響。通過相似性分型發(fā)現(xiàn)(圖2B)，PFGE相似性大于85%的菌株同源性大多集中，大多A型菌株相似性＞80%，這與PFGE結(jié)果一致性較高，然而HF281和BY217為A型菌株，但在相似性分型卻小于70%，差異性較大。

2.2.2 中度同源組

該組PFGE同源性介于70%～85%之間，菌株分型主要屬于A型(圖1)，但菌株之間具有一定的差異。應(yīng)用identical mass分型(圖3A)和相似性分型(圖3B)發(fā)現(xiàn)，主要菌株之間的identical mass＞70%，相似性＞85%，表明KPN之間同源性較高，這與PFGE結(jié)果嚴(yán)重不符，存在較大差異。

2.2.3 低度同源組

此組PFGE分析差異性較大，均＜70%，分型各自不同，屬于散發(fā)性(圖1)。采用identical mass分型(圖4A)和相似性分型(圖4B)分析同源性，顯示KPN之間identical mass＜70%，相似性＜80%，與PFGE分析相似，能較好體現(xiàn)菌株間的差別。

3 討論

肺炎克雷伯菌是常見的腸桿菌科細(xì)菌，常導(dǎo)致肺部、腸道、甚至血流等感染[8]。β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物是治療肺炎克雷伯菌感染的首選抗菌藥物，而碳青霉烯類抗生素被認(rèn)為是最后的選擇。但是，隨著臨床上抗生素的廣泛應(yīng)用及不合理使用，碳青霉烯類的耐藥率呈上升趨勢[9]。CHINET監(jiān)測發(fā)現(xiàn)2005—2018年KPN對美羅培南和亞胺培南的耐藥率從2.9%和3.0%增加到26.3%和25.0%，13年來增加約9倍[10]。因此，及時發(fā)現(xiàn)、有效控制CRKP的流行趨勢與暴發(fā)至關(guān)重要。

現(xiàn)今，臨床微生物實驗室在細(xì)菌同源性分析的方面主要以分子生物學(xué)分型居多，其中PFGE作為一直比較公認(rèn)的分型技術(shù)，具有較高的精確度和穩(wěn)定性[11-13]。但該技術(shù)由于操作繁瑣、耗時長、費用高等缺點，不作為臨床實驗室常規(guī)設(shè)備和技術(shù)手段。為了快速明確耐藥菌的分布與流行規(guī)律，醫(yī)院迫切需要一種能夠快速溯源、加強疾病防控的時效性和應(yīng)對能力的新技術(shù)。近年來，MALDI-TOF MS作為一種快速鑒定病原菌種屬的新技術(shù)，能通過分析菌株間蛋白豐度的細(xì)小差異，達(dá)到快速分析細(xì)菌同源性的目的，進(jìn)而追根溯源[14]。有研究發(fā)現(xiàn)[5]，利用MALDI-TOF MS篩選出CRKP的特征質(zhì)量峰，應(yīng)用自帶的Clinpro Tools 3.0軟件分析比較菌株間的特征質(zhì)量峰，作為其同源性分析的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。王璐等[15]研究利用MALDI-TOF MS收集臨床分離的CRKP菌株，通過自帶的SARAMIS軟件對待測菌株進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)40株CRKP以A型為主，占85%(34/40)，認(rèn)為該醫(yī)院存在以A型CRKP為主的流行傳播。在本研究中，運用SARAMIS軟件的分型工具，高度同源組identical mass大多介于60%～80%之間，分布較為集中，相似性＞80%，與PFGE分析基本相似，這在菌株一致性和非一致這兩方面上，均能較好得反映院內(nèi)病原菌流行趨勢。然而，在中度同源組中，質(zhì)譜分析結(jié)果與PFGE分析具有較大差異，這表明MALDI-TOF MS在同源性分析上具有一定的不穩(wěn)定性。結(jié)果分析：PFGE的分型原理是通過電場的不斷變化，帶動不同菌株基因組DNA序列的泳動方向，形成電泳條帶，最終達(dá)到細(xì)菌分型的目的，其本質(zhì)是微觀變化的宏觀顯示，但對于分析含有復(fù)雜DNA序列的菌株，易受到相互影響，并且PFGE操作繁瑣、耗時，電泳條帶易受到緩沖液的配制、電泳時間、電壓、操作者的技術(shù)水平等因素受限，且常規(guī)醫(yī)院少有配置有關(guān)設(shè)備[11]；PFGE作為本實驗研究目的的衡量標(biāo)準(zhǔn)，仍存在一定的局限性，后續(xù)實驗仍需通過其他常用分型技術(shù)驗證菌株分型結(jié)果的準(zhǔn)確性；MALDI-TOF MS分析菌株間的同源性是基于病原菌的蛋白質(zhì)表達(dá)豐度[16]，通過比對系統(tǒng)自帶的數(shù)據(jù)庫得出質(zhì)譜峰結(jié)果，從而得出同源性結(jié)果，其結(jié)果受到臨床菌株來源、抗生素選擇壓力、實驗室環(huán)境、操作者的嫻熟水平及待測菌株活性等因素制約，某些菌體可能存在不表達(dá)或表達(dá)過多，導(dǎo)致SARAMIS軟件分析的準(zhǔn)確性不高。在中度同源組分析中，根據(jù)PFGE分型結(jié)果，顯示菌株之間分型大多不同，且根據(jù)圖1的同源性樹狀圖發(fā)現(xiàn)，本組同源性大多介于70%～85%；應(yīng)用SARAMIS軟件，identical mass分型分析同源性，只有編號HF6791、HF1285、HF2148這3個菌株介于70%～85%，而相似性分型大多＞85%，這與PFGE的同源性樹狀圖比較，不能較好顯示出不同亞型及型別之間的一致性和不同時期播散的差異性；對于同源性較高和較低的菌株，能大致進(jìn)行分型初篩。

本研究將臨床分離的55株CRKP劃分為3組菌株：在高度及低度同源組分析中，對于菌株間的暴發(fā)流行與散發(fā)性，SARAMIS軟件能進(jìn)行粗略的初篩；在中度同源組中，尚不適用；但該技術(shù)仍存在一定的不穩(wěn)定性。由于本研究樣本量不多，其中部分菌株來源于同一科室，不能排除CRKP小范圍克隆傳播的可能，對實驗結(jié)果具有一定干擾性。并且，研究樣本的PFGE分型結(jié)果有限，僅限于監(jiān)測菌株來源的院內(nèi)流行趨勢，后續(xù)應(yīng)收集不同菌株型別，探究質(zhì)譜分析CRKP同源性的應(yīng)用價值。此外，MALDI-TOF MS采集的質(zhì)譜峰數(shù)量較多，部分存在不足，其中峰度干擾、噪聲、重復(fù)性低等因素均對分析結(jié)果造成一定的影響。因此，后續(xù)應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步增加研究對象的樣本量，擴大CRKP的菌株來源，從而完善MALDI-TOF MS分析CRKP同源性的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

綜上所述，采用MALDI-TOF MS研究CRKP的同源性，在一定程度上能夠快速追根溯源，從而增強院內(nèi)病原菌流行防控的時效性，但對于同源性復(fù)雜的實驗菌株，穩(wěn)定性不高，其應(yīng)用價值需進(jìn)一步研究，仍需更準(zhǔn)確的同源性分析技術(shù)明確流行規(guī)律，從而采取適當(dāng)措施，嚴(yán)格控制進(jìn)一步的暴發(fā)。