負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞CD4+CD25+T及其相關(guān)細(xì)胞因子在COPD患者外周血中的表達(dá)與合并細(xì)菌感染的相關(guān)性研究

侯聰霞 孫 芳 梁亞林

1 河南省胸科醫(yī)院呼吸與危重癥一病區(qū) (鄭州 450000) 2 鄭州市第七人民醫(yī)院腎移植腎病診療中心(鄭州 450016)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)具有較高的發(fā)病率和病死率，給患者及社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)，目前尚沒有阻止或逆轉(zhuǎn)COPD疾病進(jìn)程的有效治療方法[1]，因此探討其發(fā)病及進(jìn)展機(jī)制對(duì)診治有重要的臨床意義。COPD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，既往研究證實(shí)，免疫失衡是其中重要一環(huán)，而作為機(jī)體免疫重要的組成部分，細(xì)胞免疫是以T淋巴細(xì)胞為主導(dǎo)的[2]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一類特殊的T細(xì)胞亞群，具有免疫抑制性和免疫無反應(yīng)性，在維持自身耐受、免疫穩(wěn)態(tài)和抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[3]。因此，評(píng)估COPD患者外周血中的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，有助于判斷患者的免疫狀況，為了解免疫系統(tǒng)參與COPD發(fā)生進(jìn)展機(jī)制提供信息。基于此，本研究納入66例COPD患者作為研究對(duì)象，以探討CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在COPD患者外周血中的表達(dá)，及與合并細(xì)菌感染的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2018年1月—2019年12月間收治的66例COPD患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]者；年齡>18歲者；未合并其他嚴(yán)重全身性疾病、臟器功能不全者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他免疫系統(tǒng)疾病者；合并其他慢性感染性疾病者；合并其他呼吸系統(tǒng)疾病者。本研究對(duì)照組納入的均為體檢健康者。66例COPD患者中急性加重期COPD(acute exacerbation COPD,AECOPD)者36例，男26例、女10例，年齡49～74歲，平均年齡(64.83±7.68)歲；穩(wěn)定期COPD者30例，男23例、女7例，年齡51～74歲，平均年齡(65.41±7.54)歲。對(duì)照組：男22例、女8例，年齡51～69歲，平均年齡(64.99±7.18)歲。各組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 研究方法

所有研究對(duì)象均于入組時(shí)采集外周靜脈血標(biāo)本，使用淋巴分離液常規(guī)分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/mL，取100 μL懸浮細(xì)胞分別加入20 μL CD4-FITC、CD25-APC，混勻后室溫孵育，加入PBS緩沖液混勻、離心后棄去上清液，再次加入0.5 mL PBS緩沖液混勻，采用FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(美國Bectond-Dickinson公司生產(chǎn))檢測(cè)CD4+、CD4+CD25+水平。采用ELISA法測(cè)定白介素-4(interleukin-4,IL-4)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)水平，試劑均來自上海晶抗生物工程有限公司。

1.3 觀察指標(biāo)

對(duì)所有納入的研究對(duì)象外周血標(biāo)本中的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子(IL-4、IL-10、IFN-γ)表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，分析相關(guān)指標(biāo)水平與COPD是否合并細(xì)菌感染的關(guān)系，及預(yù)測(cè)細(xì)胞感染的效能。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 外周血T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平

AECOPD和穩(wěn)定期COPD患者CD4+、CD4+CD25+水平均低于對(duì)照組(P<0.05)，AECOPD患者CD4+、CD4+CD25+水平低于穩(wěn)定期COPD患者(P<0.05)，見表1。

表1 外周血T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平

續(xù)表

2.2 外周血血清細(xì)胞因子表達(dá)水平

AECOPD和穩(wěn)定期COPD患者IL-4、IL-10水均高于對(duì)照組(P<0.05)，IFN-γ/IL-4水平低于對(duì)照組(P<0.05)，AECOPD患者IFN-γ水平高于對(duì)照組(P<0.05)；AECOPD患者IL-4、IL-10、IFN-γ均高于穩(wěn)定期COPD患者(P<0.05)，見表2。

表2 外周血血清細(xì)胞因子表達(dá)水平

2.3 COPD患者外周血T淋巴細(xì)胞表達(dá)與血清細(xì)胞因子的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析法顯示：COPD患者外周血CD4+、CD4+CD25+水平均與IL-4、IFN-γ呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，CD4+水平與IL-10呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，見表3。

表3 COPD患者外周血T淋巴細(xì)胞表達(dá)與血清細(xì)胞因子的相關(guān)性

2.4 COPD合并感染者T淋巴細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的水平

36例AECOPD患者中合并細(xì)菌感染者27例，其中革蘭氏陰性菌感染者19例、革蘭氏陽性菌感染者8例，無真菌感染病例。COPD合并感染者CD4+水平低于未合并感染者(P<0.05)，IL-4、IFN-γ水平均高于未合并感染者(P<0.05)；COPD合并革蘭氏陰性菌感染者CD4+CD25+水平低于未合并感染者(P<0.05)，IL-10水平均高于未合并感染者(P<0.05)，見表4。

表4 COPD合并感染者T淋巴細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的水平

2.5 T淋巴細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子預(yù)測(cè)細(xì)菌感染的效能

ROC曲線顯示：CD4+、IL-4、IL-10、IFN-γ均是預(yù)測(cè)COPD患者合并細(xì)菌感染的有效指標(biāo)(P<0.05)，其中IL-4和IFN-γ效能較高(P<0.05)，見表5。

表5 T淋巴細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子預(yù)測(cè)細(xì)菌感染的效能

圖1 T淋巴細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的ROC曲線

3 討 論

既往文獻(xiàn)證實(shí)，COPD的發(fā)病機(jī)制不僅在于肺部出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，還在于全身免疫系統(tǒng)的變化，T淋巴細(xì)胞除了參與COPD的炎癥過程，還參與調(diào)整COPD的免疫功能[5]。且有研究顯示，T淋巴細(xì)胞相關(guān)血清細(xì)胞因子在COPD發(fā)病進(jìn)展中會(huì)發(fā)生顯著變化[6]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在COPD并發(fā)肺部感染患者中炎性因子和Th17均呈高表達(dá)，Treg呈低表達(dá)，Th17/Treg失衡及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可影響患者的肺功能[7]。但在COPD疾病狀態(tài)下，有關(guān)免疫細(xì)胞與其血清細(xì)胞因子間相互作用機(jī)制變化的報(bào)道仍少見。這不利于了解細(xì)胞免疫在COPD病程中的具體機(jī)制，為改善COPD免疫輔助治療及預(yù)測(cè)患者細(xì)菌感染等病情變化，本研究展開相關(guān)探討。

本研究結(jié)果顯示，不同病情COPD患者CD4+、CD4+CD25+水平均顯著低于健康人群，病情嚴(yán)重者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)更低。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞主要通過細(xì)胞間接、直接接觸或分泌抑制性細(xì)胞因子來抑制自身效應(yīng)性細(xì)胞活化，參與免疫負(fù)調(diào)節(jié)，維持自身免疫耐受[8]。因此，COPD患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量減少，一是表明AECOPD可能由于CD4+CD25+水平減少，而使患者更易發(fā)生病理性免疫應(yīng)答，呼吸系統(tǒng)出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)；二是考慮COPD穩(wěn)定期患者也存在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞變化，這可能是引起COPD疾病慢性化和反復(fù)發(fā)作的機(jī)制之一。不同T細(xì)胞具有不同細(xì)胞因子產(chǎn)生模式，其中IFN-γ以Th1細(xì)胞產(chǎn)生為主，IL-4、IL-10以Th2細(xì)胞產(chǎn)生為主[9]，因此觀察IFN-γ、IL-4水平及其比值有助于判斷T細(xì)胞因子水平的平衡。在細(xì)胞因子層面，本研究數(shù)據(jù)顯示，AECOPD和穩(wěn)定期患者血清細(xì)胞因子表達(dá)水平均顯著升高，但呈現(xiàn)病情越重、IFN-γ/IL-4比值水平越低的狀況。這說明在COPD患病人群中均出現(xiàn)免疫反應(yīng)，IFN-γ、IL-4水平均升高，但I(xiàn)FN-γ升高幅度不及IL-4，致使患者免疫失衡，與CD4+CD25+Treg細(xì)胞降低的趨勢(shì)保持一致。IL-4能激活B淋巴細(xì)胞合成IgE和IgG1，引起喘息癥狀的發(fā)作和加劇；且能促進(jìn)黏液糖蛋白合成，杯狀細(xì)胞增生及氣道黏液分泌等，導(dǎo)致了氣道炎癥和重構(gòu)[10]。進(jìn)一步通過評(píng)估Treg細(xì)胞與血清細(xì)胞因子的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，AECOPD疾病狀態(tài)下，兩者呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，CD4+CD25+Treg表達(dá)水平變化是COPD患者免疫平衡的重要機(jī)制，也會(huì)影響機(jī)體炎性反應(yīng)和病情進(jìn)展。

感染是AECOPD患者的常見影響因素[11]，符夢(mèng)楠等[12]學(xué)者發(fā)現(xiàn)病原菌感染以革蘭氏陰性菌為主，與本研究結(jié)果一致。原因是，AECOPD患者以老年人為主，多數(shù)伴有其他基礎(chǔ)疾病，免疫功能低下，易出現(xiàn)腸道內(nèi)革蘭氏陰性菌過度增殖并發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移，且革蘭陰性菌對(duì)呼吸道黏膜上皮黏附性較強(qiáng)[13]。COPD合并細(xì)菌感染會(huì)影響病情嚴(yán)重程度，干擾患者治療效果，延長其住院時(shí)間。本研究結(jié)果顯示，AECOPD患者中合并細(xì)菌感染者Treg細(xì)胞與相關(guān)細(xì)胞因子均和未合并感染者存在差異，尤其是革蘭氏陰性菌感染者，提示上述指標(biāo)在預(yù)測(cè)細(xì)菌感染中的可行的。既往文獻(xiàn)證實(shí)，在合并有細(xì)菌等病原體感染的COPD中，細(xì)菌體裂解分解產(chǎn)物能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，促使炎癥反應(yīng)加重[14-15]。革蘭陰性菌主要通過產(chǎn)生內(nèi)毒素致病[11]，可能與內(nèi)毒素誘導(dǎo)血清細(xì)胞因子水平較強(qiáng)有關(guān)。其中，IL-4和IFN-γ是預(yù)測(cè)COPD患者合并細(xì)菌感染的良好效能指標(biāo)。與病原菌培養(yǎng)相比，血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)更便捷，具有一定實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，但也需更多研究進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，CD4+、CD4+CD25+Treg細(xì)胞表達(dá)與COPD發(fā)病、病情進(jìn)展、細(xì)菌感染均存在關(guān)聯(lián)，不同病情嚴(yán)重程度COPD患者均有免疫功能失衡且會(huì)影響相關(guān)細(xì)胞因子水平，CD4+CD25+Treg相關(guān)細(xì)胞因子水平預(yù)測(cè)患者是否合并細(xì)胞感染效能良好。