樣品不同運輸時長對小反芻獸疫病毒抗體檢測結果的影響

洛松西熱，王玉恒，吉哈利，于子淇，胡劍武，旦增卓瑪

（1.西藏自治區獸醫生物藥品制造廠，西藏 拉薩 850000；2.西藏自治區獸醫局，西藏 拉薩 850000；3.西藏蓮莖生物科技有限公司，西藏 拉薩 850000）

西藏自治區位于青藏高原西南部，動物資源尤為豐富，其中大中型野生動物數量居全國第一。養殖牛羊可為西藏農牧民帶來經濟收入，但小反芻獸疫、牛結節性皮膚病等重大動物疫病會影響養殖效益，因此進行動物疫病抗體檢測尤為重要[1]。目前酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是動物疫病抗體的主要檢測方法。血清抗體是一種免疫蛋白，其蛋白質量會直接影響動物疫病抗體檢測結果的準確性[2]。由于西藏地廣、道路崎嶇、養殖戶分散等原因，導致樣品運輸時間相對較長，有可能會影響抗體檢測結果[3-5]。目前，傳統樣品運輸方式為泡沫箱加冰袋，這種方法雖然便捷，但受外圍環境影響有一定時限性，可能會對血清抗體檢測結果造成一定影響[6-8]。因此，探究泡沫箱的保溫效果及其對血清檢測結果的影響尤為重要。

本試驗模擬不同運輸溫度，采用傳統運輸方式探究泡沫箱內溫度變化以及保存時長對小反芻獸疫病毒抗體檢測結果的影響，為動物疫病檢測工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

小反芻獸疫活疫苗（Clon9株）由西藏自治區獸醫生物藥品制造廠提供，批號 202101；小反芻獸疫競爭ELISA抗體檢測試劑盒采購于青島立見生物科技有限公司，批號20172107。

1.2 主要儀器

酶標分析儀采購于北京普朗新技術有限公司，型號DNM-9602；恒溫培養箱采購于上海鴻都科技有限公司，型號SHP-300；高速冷凍離心機采購于湖南星科科學儀器有限公司，型號TGL16；4 ℃冰箱采購于海爾集團，型號BCD-223WDPT；溫度計經深州天溯計量檢測股份有限公司校驗，校驗證書編號Z20211-G208274，其他耗材均為國產。

1.3 樣品來源

試驗動物為20頭2～3月齡的西藏本地山羊，按照小反芻獸疫疫苗免疫劑量說明書進行頸部皮下免疫。免疫21 d后，頸靜脈采全血10 ml，4 ℃ 10 000 r/min，5 min分離血清。將10份血清樣品分裝為3份，保存于1.5 ml離心管。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗設計 本試驗共設3個試驗組，分別為4 ℃試驗組、25 ℃試驗組、37 ℃試驗組。在3個泡沫箱（內尺寸250 mm×110 mm×130 mm；外尺寸300 mm×140 mm×230 mm）中分別放入10份山羊血清樣品和3個冰袋（約300 g），放置于37 ℃恒溫培養箱、25 ℃恒溫培養箱和4 ℃冰箱。將溫度計插入泡沫箱內，定期觀察溫度變化。

1.4.2 抗體檢測方法 在血清樣品放置0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h后，分別取出少量血清用于抗體檢測。根據小反芻獸疫病毒抗體檢測試劑盒說明書進行操作。先在陰性對照孔、陽性對照孔和空白對照孔各加入50 μl陰、陽性對照樣品和樣品稀釋液，樣品檢測孔加入25 μl樣品稀釋液和25 μl血清樣品，震蕩混勻，37 ℃孵育60 min，每孔加入300 μl洗滌液，洗滌4次。然后每孔加入50 μl酶標抗體，37 ℃孵育30 min，再加入300 μl洗滌液，洗滌4次，再加入50 μl底物溶液，室溫避光孵育15 min。最后每孔加入50 μl終止液，于450 nm波長處測定各孔吸光值。

1.4.3 抗體檢測判定方法 標準樣品判定：陽性對照樣品抑制率（PI）=（1-陽性對照孔吸光值/空白對照孔吸光值）×100%＞60%；陰性對照樣品抑制率（PI）=（1-陰性對照孔吸光值/空白對照孔吸光值）×100%＜40%；結果判定：樣品抑制率（PI）=（1-待檢樣品吸光值/空白對照孔吸光值）×100%，PI＞50%為陽性，PI≤50%為陰性。

1.5 數據分析

應用Microsoft Excel 2010版軟件對試驗羊的血清樣品抗體水平進行分析，統計數據用平均數±標準差（Mean±SD）表示。

2 結果

2.1 不同環境溫度對泡沫箱內的溫度影響

2.1.1 4 ℃環境溫度對泡沫箱內的溫度影響 由圖1可知，當環境溫度為4 ℃時，泡沫箱內溫度變化趨勢較平緩，其中在16～20 h泡沫箱內溫度維持在最低溫度（1 ℃），在56 h達到最高溫度（5 ℃），其余時間段均維持在2～4 ℃。

圖1 4 ℃時泡沫箱內的溫度變化

2.1.2 25 ℃環境溫度對泡沫箱內的溫度影響 由圖2可知，當環境溫度為25 ℃時，泡沫箱內溫度變化趨勢為階段性升高，其中在4～40 h泡沫箱內溫度維持在9～12 ℃，在40～56 h泡沫箱內溫度上升至20 ℃，在56～72 h泡沫箱內溫度維持在22～25 ℃。

圖2 25 ℃時泡沫箱內的溫度變化

2.1.3 37 ℃環境溫度對泡沫箱內的溫度影響 由圖3可知，當環境溫度為37 ℃時，泡沫箱內溫度變化趨勢為對數性升高，其中在4～20 h泡沫箱內溫度升高至20 ℃，在24～40 h泡沫箱內溫度升高至30 ℃，在40～72 h時泡沫箱內溫度升高至38 ℃。

圖3 37 ℃時泡沫箱內的溫度變化

2.2 標準樣品檢測結果

由表1可知，陽性對照組抑制率（PI）為88.59%＞60%，陰性對照組抑制率（PI）為4.52%＜40%。根據樣品判定標準可知，本次試驗的陽性對照和陰性對照成立，進一步表明可根據試劑盒內結果判定標準對檢測血清樣品進行判定。

表1 陽性對照組和陰性對照組檢測結果

2.3 不同運輸時長對抗體檢測結果的影響

由表2、表3可知，運輸時長為12 h時，4 ℃試驗組、25 ℃試驗組和37 ℃試驗組的平均吸光值均維持在0.025，平均阻斷率（PI）均為80%；運輸時長為24～36 h時，4 ℃試驗組和25 ℃試驗組的平均吸光值和平均阻斷率相差不大，但均比37 ℃試驗組的平均阻斷率低2%～3%；運輸時長超過48 h時，4 ℃試驗組的平均阻斷率基本穩定，但25 ℃試驗組和37 ℃試驗組的平均阻斷率均下降2%～5%。

表2 不同運輸時長對樣品吸光值的影響

表3 不同運輸時長對樣品阻斷率的影響

3 討論

在小反芻獸疫、牛結節性皮膚病等動物疫病的流行下，對牛羊等動物抗體效價檢測尤為重要[1]。只有評估抗體效價才能真正監控牛羊等動物群體的免疫動態。由于溫度、時間等運輸條件會對血清樣品質量造成一定影響[2-5]，所以對運輸條件的探索有重要意義。本試驗模擬4 ℃、25 ℃和37 ℃外界環境條件，探索泡沫箱內溫度變化。結果顯示當環境溫度為4 ℃時，泡沫箱內溫度變化趨勢較平緩；當環境溫度為25 ℃時，泡沫箱內溫度變化趨勢為階段性升高，在56～72 h泡沫箱內溫度維持在22～25 ℃；當環境溫度為37 ℃時，泡沫箱內溫度變化趨勢為對數性升高，在24～40 h泡沫箱內溫度升高至30℃，在40～72 h泡沫箱內溫度升高至38 ℃。結果表明，外界溫度為4 ℃時，泡沫箱內溫度會維持在6 ℃以下；外界溫度為25 ℃時，在24 h內泡沫箱內溫度會維持10 ℃以下；外界溫度為37 ℃時，在8 h內泡沫箱內溫度會維持15 ℃以下，進一步表明外界環境溫度與泡沫箱內溫度密切相關。利用酶聯免疫吸附試驗檢測不同運輸時長對血清抗體水平的影響，結果表明隨著運輸時長的增加，4 ℃試驗組的平均吸光值和平均阻斷率基本維持不變；在運輸時長超過48 h時，25 ℃試驗組的平均阻斷率會降低2%～3%；運輸時長超過24 h時，37 ℃試驗組的平均阻斷率會降低2%～5%。不同運輸時長對血清抗體檢測結果充分表明，泡沫箱加冰袋的傳統運輸方法運輸血清樣品時，運輸時長不宜超過12 h，才能保證檢測結果的準確性。