蠟樣芽孢桿菌的抗逆性研究

張海艷，劉 芳，姜旭芳

（洛陽師范學院 生命科學學院，河南 洛陽 471934）

蠟樣芽孢桿菌屬芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬[1]，是兼性需氧性革蘭氏陽性菌[2]。蠟樣芽孢桿菌產生芽孢時對高溫、高酸和高堿產生很強的抗逆性，對部分抗生素產生一定的耐受性[3]。抗生素的過量使用及畜牧產品藥物殘留對環境的污染，導致越來越多的細菌對抗生素產生了耐藥性，如何利用生物防治避免化學防治的弊端成為當今的熱點問題之一[4]，無毒、無害的微生態制劑（將有益微生物經鑒定、篩選、發酵培養等制成的一種活菌制劑[5]）逐漸被大量研究。目前大多數益生菌抗逆性差，耐高溫及酸堿的能力弱，添加在飼料中無法保證產品的有效性。芽孢桿菌能產生芽孢，抗逆性強，可彌補益生菌的不足，抗性及產孢條件是芽孢桿菌研究的熱點[6]。無毒的蠟樣芽孢桿菌是一種對宿主有益的益生菌，生長繁殖過程中產生的大量營養物質，通過改善腸道微生態環境、增強機體免疫力防治疾病、促進動物生長發育[7-8]，利用自身產生的抗菌物質殺死細菌，不會使細菌產生耐受性，不會給環境帶來毒害殘留物，減輕了環境污染。蠟樣芽孢桿菌耐高溫、耐高酸、耐高堿，能夠提高飼料轉化率及利用率，是一種理想的動物飼料添加劑，同時在人體保健醫療、植物生長促進劑等領域的應用潛力較大[9]。

微生態制劑的應用要考慮菌株能否通過胃酸的消化，飼料加工時高溫能否殺死菌株及菌株產生最佳作用效果的培養條件。本研究基于以上問題，探究了蠟樣芽孢桿菌的生長特性、耐酸堿性、耐高溫性、對抗生素的耐受性及實現最大生物產量的培養條件。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：蠟樣芽孢桿菌由洛陽師范學院生命科學院動物營養與健康研究室提供。培養基：LB固體培養基、LB液體培養基，參照文獻配制[10-11]。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化 將冷藏保存的蠟樣芽孢桿菌用接種環在LB固體培養基表面劃線，在37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，挑取單個菌落到LB液體培養基中，37 ℃、220 r/min搖床培養12 h。

1.2.2 種子液制備 吸取1 ml菌液，12 000 r/min離心2 min，棄上清液，加1 ml PBS搖勻后離心2 min，棄上清液，加1 ml PBS搖勻后，用酶標儀測OD值，以OD600值=0.5的菌液為種子液。

1.2.3 生長曲線繪制 取種子液以1%的量接種至LB液體培養基中，在37 ℃、轉速220 r/min的搖床中培養8 h后測OD600值，之后每隔4小時吸取1 ml菌液測OD600值，繪制菌種生長曲線。

1.2.4 活菌及芽孢測定方法 活菌：傾注法活菌計數[12]。芽孢：培養菌液80 ℃水浴加熱10 min，充分滅活營養體菌體細胞后以傾注法進行活菌計數[13]。

2 結果與分析

2.1 生長曲線

0～16 h蠟樣芽孢桿菌生長較快，以對數的方式增值；16～24 h菌株新增和死亡達到平衡，蠟樣芽孢桿菌生長基本進入穩定期；24 h后蠟樣芽孢桿菌進入衰亡期，培養基中的營養物質及氧氣消耗導致菌株消亡，菌株數不斷減少（圖1）。

圖1 蠟樣芽孢桿菌生長曲線

2.2 溫度對活菌數和存活率的影響

隨著溫度的升高，活菌數逐漸下降，但蠟樣芽孢桿菌的存活率較高，以37 ℃為空白對照，在90 ℃和100 ℃的高溫下處理10 min，存活率分別達83.7%和83.4%，說明蠟樣芽孢桿菌耐高溫（圖2）。

圖2 溫度對活菌數和存活率的影響

2.3 pH對活菌數和存活率的影響

以pH=7為空白對照，pH值分別為2、9時，蠟樣芽孢桿菌的存活率均在80%以上，說明蠟樣芽孢桿菌耐酸堿（圖3）。動物胃腸道的pH值為2～3，小腸的pH值為5～7，動物飼料的pH值為6.2～6.8，均對蠟樣芽孢桿菌的生長影響不大。

圖3 pH對蠟樣芽孢桿菌活菌數和存活率的影響

2.4 培養時間對蠟樣芽孢桿菌生長和產孢率的影響

活菌數和芽孢數都隨培養時間先增加后減少，且都在24 h達到最佳，此時產孢率為93.1%，所以24 h為蠟樣芽孢桿菌的最佳培養時間（圖4）。

圖4 培養時間對蠟樣芽孢桿菌 生長和產孢率的影響

2.5 初始pH值對蠟樣芽孢桿菌生長和產孢率的影響

初始pH=7.5時，蠟樣芽孢桿菌活菌數最多，但此時芽孢數不是最多；初始pH=6.5時，芽孢數最多且產孢率最高（圖5）。因此，最佳初始pH值為6.5。

圖5 初始pH值對蠟樣芽孢桿菌 生長和產孢率的影響

2.6 裝液量對蠟樣芽孢桿菌生長和產孢率的影響

蠟樣芽孢桿菌為好氧菌，裝液量少時通氣量大、氧氣含量高，有利于菌株生長和芽孢形成。裝液量為25 ml時活菌數、芽孢數和產孢率均達到最大，因此裝液量以25 ml為最佳（圖6）。

圖6 裝液量對蠟樣芽孢桿菌生長和產孢率的影響

2.7 蠟樣芽孢桿菌對抗生素的耐受性

由表1可知，蠟樣芽孢桿菌對赤霉素有高濃度的耐受性，對硫酸卡那霉素和硫酸鏈霉素有低濃度的耐受性。在飼料中添加上述抗生素不會抑制菌株的作用效果。

表1 蠟樣芽孢桿菌對抗生素的耐受性

3 結論與討論

蠟樣芽孢桿菌具有很好的抗逆性，對赤霉素、硫酸鏈霉素、硫酸卡那霉素均具有一定的耐受性，其最佳產孢條件為培養溫度37 ℃、培養時間24 h、初始pH值6.5、裝液量25 ml；蠟樣芽孢桿菌可作為生物制劑添加在動物飼料中。

蠟樣芽孢桿菌作為微生態制劑應用十分廣泛，作為飼料添加劑改變了凡納濱對蝦腸道微生物的組成，提高了對蝦的生長速度[14]。劉一塵等[15]認為蠟樣芽孢桿菌能夠促進動物消化吸收，提高飼料轉化率及利用率。陳旭東等[16]研究發現，蠟樣芽孢桿菌能產生細菌素和拮抗致病菌。雖然強調以活的菌種添加在動物飼料中，但實際應用中多為芽孢桿菌的死菌，目前死菌與活菌的作用效果是否一致，不同微生物制劑的添加量是否會引起不同的效果，模擬酸度與動物胃酸的效果是否一致等問題仍需進一步研究和探討。