不同佐劑對口蹄疫滅活疫苗穩定性的影響

張 榮，武永淑，李 菁，安芳蘭，劉學榮

（中農威特生物科技股份有限公司，甘肅 蘭州 730046）

口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的一種急性傳染病，主要感染偶蹄類動物，傳播途徑多，速度快，發病率高，目前已有67%的OIE成員國流行FMD，嚴重威脅著周邊國家和地區的家畜安全及畜產品貿易。口蹄疫傳入中國后，給我國畜牧養殖業也造成了巨大的經濟損失[1]。疫苗免疫接種仍然是目前防控口蹄疫病毒感染的最有效手段和措施[2]，為有效防控傳染病和推動畜牧業的發展提供了有力保障。目前市場上占主導地位的仍是口蹄疫滅活疫苗[3]，一些新型的疫苗也在不斷被開發和應用[4]。佐劑是指與抗原同時使用，能夠增強機體對抗原適應性免疫應答能力的一類物質[5]，是疫苗制備中至關重要的因素，能夠提高疫苗對機體的保護力，減少疫苗用量，從而降低生產成本[6]。目前國內口蹄疫疫苗市場上應用最廣泛的是法國SEPPIC公司的Montanide ISA 206佐劑[7-8]。國產佐劑規模化應用的還比較少，嚴重依賴國外進口，成本較高。中國是世界上公認的養豬大國，養殖量約占世界總量的50%，為了降低成本，選擇一種可以代替進口佐劑、適用于口蹄疫滅活疫苗商業化應用的新型國產佐劑是口蹄疫疫苗生產廠家急需解決的問題。本研究通過利用3種不同佐劑與口蹄疫O型抗原（毒株）配制3組不同口蹄疫O型滅活疫苗，以ISA 206佐劑配制的疫苗作為對照組，Well佐劑和ISA 201佐劑作為試驗組，比較評價這3組口蹄疫滅活疫苗的物理性狀、146S含量變化及對豬的免疫應答水平，以期為口蹄疫疫苗廠家選擇佐劑提供數據支持。

1 材料

1.1 抗原與佐劑

抗原：口蹄疫O型滅活抗原（MYA98/OM）（中農威特生物科技股份有限公司）。

佐劑：ISA 206佐劑和ISA 201佐劑（法國SEPPIC公司），Well佐劑（南京威爾藥業集團股份有限公司）。

1.2 儀器與試劑

粒度分析儀（布魯克海文），高速離心機（賽默飛世爾），酶標儀（Bio-Rad），頂置式攪拌器EUROSTAR 40（IKA），口蹄疫血清抗體檢測ELISA試劑盒（中國農業科學院蘭州獸醫研究所）。

2 方法

2.1 乳化

將ISA 206佐劑、ISA 201佐劑以及Well佐劑分別于121 ℃高壓滅菌30 min，同一批次的抗原在無菌條件下分成3份各50 g，146S含量為10 μg/ml，將以上3種佐劑和抗原分別置于31 ℃水浴中恒溫30 min后，分別等質量混合，利用EUROSTAR 40攪拌器350 r/min乳化5 min，分裝于疫苗瓶中編號待測。

2.2 物理性狀檢測

按現行《中華人民共和國獸藥典》附錄進行性狀檢驗[9]。

粘度檢測：在25 ℃條件下，用1 ml吸管分別吸取上述3種不同的疫苗，垂直自然流出，計算0.4 ml流出所需要的時間。

離心檢測：取10 ml疫苗于15 ml離心管中，以3 000 r/min轉速離心15 min。

劑型檢測：室溫下，用移液器分別吸取上述3組疫苗各1 ml，快速滴于100 ml純水表面，如果分散呈云霧狀則為水包油包水。

粒徑檢測：以PBS作為稀釋液，吸取2 μl疫苗于4 ml PBS中，吹打均勻，置于樣品槽中利用粒度分析儀檢測粒徑大小。

穩定性試驗：將3種疫苗分別存放在4 ℃和37 ℃環境下，在15 d、30 d、45 d和60 d觀察其分層情況，并檢測疫苗中146S含量變化。

2.3 免疫動物試驗

將上述3種不同佐劑制備的口蹄疫滅活疫苗免疫35～45 kg的架子豬各10只，免疫劑量為0.2 ml，在免疫14 d、21 d、28 d、60 d、90 d、120 d和150 d分別進行靜脈采血，用口蹄疫液相阻斷ELISA試劑盒檢測血清中抗體含量，判斷3組不同佐劑乳化的口蹄疫滅活疫苗對試驗動物的整體免疫抗體水平。

3 結果及分析

3.1 物理性狀檢測

將Well、ISA 201和ISA 206 3種不同的佐劑分別與口蹄疫滅活抗原乳化成疫苗，物理性狀檢測均達到標準。吸取疫苗快速滴入水中，三者分散均呈云霧狀，劑型為W/O/W型，見圖1。3種疫苗的粒徑分別為247 nm、234 nm、220 nm，見圖2。離心未出現分層情況，粘度均在2～8 s范圍內。

圖1 3種疫苗的劑型檢測

圖2 3種疫苗的粒徑大小

3.2 放置試驗

將所制備的3種疫苗分別放置在4 ℃和37 ℃環境下，觀察疫苗的分層情況并檢測其146S含量變化，見表1。在4 ℃條件下，與ISA 201和Well佐劑相比，ISA 206佐劑制備的FMD滅活疫苗穩定性較好，保存60 d 146S的降解率為31%，而ISA 201為49%，Well為65%；在37 ℃條件下，Well佐劑在45 d就降解為0，而ISA 206和ISA 201都是60 d降解為0，見圖3。

圖3 3種疫苗在不同條件下的146S含量變化

表1 不同溫度條件下3種疫苗的146S含量變化

3.3 動物免疫效果評價試驗

將所制備的3種不同口蹄疫滅活疫苗免疫架子豬，用液相阻斷ELISA方法檢測動物血清中的抗體含量，并計算Log10（效價）對照值求平均數及標準差。抗體結果如表2所示。利用GraphPad Prism軟件進行組間多重比較，P＜0.05表示差異顯著，結果見圖4。試驗結果表明，ISA 206佐劑配制的FMD滅活疫苗的平均抗體水平高于其他兩組，能顯著提高動物血清中特異性抗體的水平。與篩選的新型佐劑相比，大規模用于獸用疫苗的ISA 206佐劑的穩定性和免疫效價較好。

圖4 3種佐劑配制的疫苗150 d內血清平均抗體效價消長圖

表2 3種佐劑配制的疫苗150 d內血清平均抗體效價消長情況

4 討論及結論

新型雙相乳劑呈多相分散體系，含有內部水滴的油滴分散成連續的水相，制備的疫苗可以同時提供抗原從外部水相的快速釋放和從內部水相的延長釋放，能快速、持續地刺激體液免疫應答[5]。本試驗選擇2種雙相佐劑（Well佐劑和ISA 201佐劑）與現在使用的ISA 206佐劑，跟中農威特生物科技股份有限公司同批次的FMD O型抗原進行乳化制備疫苗，在對3種口蹄疫滅活疫苗的物理性狀如劑型、粘度、粒徑大小、離心效果及穩定性進行全面評價后，證明3種佐劑疫苗均達到了評判的質量標準。將制備的3種疫苗免疫動物，分別在14 d、21 d、28 d、60 d、90 d、120 d和150 d靜脈采血，利用O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒檢測血清中的抗體效價，結果顯示這3組疫苗都隨著免疫天數的增加，抗體水平也相應增加，在90 d時達到最大、120 d時呈下降趨勢，其中ISA 206佐劑組抗體水平明顯高于其他兩組。以上結果表明，與ISA 201佐劑和Well佐劑相比，ISA 206佐劑在疫苗穩定性和免疫效果方面表現得更好，這為進一步篩選新型國產疫苗佐劑提供了數據支持。乳劑在獸用疫苗的制備中具有廣闊的市場前景，乳劑類佐劑的基本組成成分在自然界中是比較容易獲得的，并且價格較為低廉，作為遞送類佐劑的代表，研究適合于口蹄疫滅活疫苗商業化生產的國產佐劑，是目前口蹄疫滅活疫苗生產廠家亟待解決的問題。