光強調制型SPRi生物傳感器的應用及分析方法

朱天逸 許晟熙 李杭 劉星宇 王詩韻

摘? 要：表面等離體激元共振是一種在生物化學、生物分析化學和生物醫學等領域中得到廣泛應用的光學傳感技術，因其高通量、無需標記、高靈敏度等優點受到越來越廣泛的重視。該研究通過分析SPRi（SPRi maging）傳感器對不同折射率的樣品與共振角的檢測規律，得出系統應用于樣品折射率、生物膜樣品厚度分布及覆蓋面密度檢測的方法;從兩種物質相互作用的平衡反應原理推導、分析了SPRi傳感器進行實時分子相互作用檢測的方法，為SPRi傳感器的應用實驗提供借鑒。

關鍵詞：SPRi;生物傳感器;分子相互作用

中圖分類號：TP212? ? ? ? ?文獻標識碼：A文章編號：2096-4706（2022）01-0113-03

Abstract： Surface plasmon resonance is an optical sensing technology widely used in biochemistry， bioanalytical chemistry and biomedicine and other fields. It has attracted more and more attention because of its high throughput， no marking required and high sensitivity. By analyzing the detection law of SPRi （SPRi maging） sensor for samples with different refractive index and resonance angle， this study obtains the method applied to the detection of sample refractive index， biofilm sample thickness distribution and coverage density; based on the equilibrium reaction principle of the interaction between two substances， the method of real-time molecular interaction detection by SPRi sensor is deduced and analyzed， which provides reference for the application experiment of SPRi sensor.

Keywords： SPRi; biosensor; molecular interaction

0? 引? 言

表面等離體激元共振（surface plasmon resonance， SPR）是一種20世紀90年代發展起來的表面光學分析技術[1-3]。具有靈敏度高、生物樣品無須標記、無須純化、實時監測、速度快、樣品消耗量少、無損傷等特點，廣泛應用于生物、化學、藥學、醫學、環境科學檢測，特別是在生物大分子相互作用的實時檢測、醫療診斷、藥物開發、環境監測、食品安全等領域具有獨特的優勢。SPR生物傳感器可以實現生物分子相互作用的無標記、高靈敏度和實時分析，可以在生物化學、生物分析化學和生物醫學中廣泛應用[4，5]。這種方法已經成功應用到不同生物分子相互作用的研究中，比如抗原—抗體[6，7]、蛋白質-DNA[8]、DNA雜交[9]、DNA-RNA[10，11]和蛋白質-糖類[12，13]的相互作用。

SPR傳感器原理為，一束p偏振光以大于臨界角的入射角θ照射在玻璃與金屬膜界面，發生全內反射;改變θ，當表面等離體波波矢ksp與光波在界面方向的分量kx匹配相等時，會發生反射光被金屬等離子體吸收現象，激發表面等離體激元共振，反射光能量急劇下降，達到最低。SPR對金屬膜表面的介質的折射率的改變極其敏感，折射率的微小變化都會引起SPR角的變化，對同一種介質，在金屬膜表面的結合量不同同樣會引起SPR響應強度的不同。基于這樣原理，SPR生物傳感器主要應用在檢測樣品折射率、檢測生物膜厚度及覆蓋面密度、實時檢測生物分子相互作用?；诖?，本研究將對SPR傳感器對金膜表面貼附的不同樣品的折射率與共振角的檢測規律進行分析，得出系統應用于樣品折射率、生物膜樣品厚度分布及覆蓋面密度檢測的原理;并從兩種物質相互作用的平衡反應原理推導、分析SPR傳感器進行實時分子相互作用檢測的方法，為SPR傳感器的系統設計及后續的應用實驗奠定重要的理論基礎。

1? 檢測樣品折射率變化

折射率是表征各種材料光學性質的重要參數，反映了介質的光學性質，一定條件下可以根據介質的折射率來了解介質的光學性能、純度、質量濃度以及色散和性質。根據敘述的表面等離體激元共振的基本原理，玻璃表面所覆蓋介質的折射率的細微改變都會引起共振條件的改變，從而引起共振角度θSPR的改變，這里將討論折射率的改變與共振角變化之間的相互關系。

建立一種三層薄膜Kretschmann結構模型，如圖1所示。系統介質共5種，入射光波長λ=632.8 nm，其中棱鏡選用ZF12，折射率n0=1.711 29;蓋玻片折射率為n1=1.516 8，厚度d1=0.2 mm;鉻厚度d2=5 nm，折射率n2=2.97;金膜厚度d3= 50 nm，折射率n3=0.219 6+3.323 9i，所測樣品折射率n4在1.331～1.345范圍內逐漸增加，根據推導的多層薄膜光學系統的反射率公式得到不同樣品折射率的SPR曲線。

從SPR曲線中可以得到每種折射率溶液對應不同的共振角θSPR，隨著樣品折射率的增加，共振角度也是不斷增大的，在某一固定入射角度，樣品折射率越大，其對應的反射率也越大。進一步得到環境折射率與共振角的關系圖，環境折射率與共振角存在很好的線性關系，曲線經過線性擬合得到線性相關系數為1，二者的關系式：

根據這個關系，可以在實際檢測實驗中，由不同環境介質中測得的共振角計算出相應的環境折射率，再根據折射率與溶液質量濃度之間的函數關系計算得到溶液的濃度分數。

2? 檢測樣品厚度及覆蓋面密度

在當前分子生物學、細胞生物學研究領域中，生物膜受到越來越多的關注。生物膜的主要成分是磷脂分子，磷脂分子與其他脂分子雖然不是生物大分子，但是眾多的脂分子可以自組裝成膜。除了常見的脂單層膜和雙層膜的研究，脂質體也是脂質膜研究的一種常見對象。

建立一種半圓柱形三層薄膜Kretschmann結構模型，系統介質共5種，分別為棱鏡、鉻層、金膜、生物膜和環境介質。入射光波長λ=632.8 nm，其中棱鏡折射率n0=1.761 82，鉻厚度d1=5 nm，折射率n1=2.97，金膜厚度d2=50 nm，折射率n2=0.219 6+3.323 9i，環境介質假設為水，折射率n4=1.33，生物膜樣品的折射率n3從1.40以步長為0.05變化到1.55，厚度d3從0變化到400 nm。

在生物膜厚度小于10 nm的條件下，生物膜厚度d3與SPR共振角θSPR存在著線性關系，即SPR生物傳感器能夠線性地響應樣品的輸入信號。橢偏儀測得脂質膜的折射率為1.45，分別模擬計算脂質膜厚度為0 nm、3 nm、5 nm、8 nm、10 nm的SPR曲線，并計算出共振角θSPR與脂質膜厚度d3的關系，如圖2所示。從擬合的結果看，共振角θSPR與脂質膜厚度d3存在很好的線性關系，其線性線性相關系數為1，擬合結果為：

利用這個線性關系，實際應用中可以根據檢測到的共振角θSPR來計算金膜上脂質膜覆蓋的厚度。已知單層脂質膜的厚度是3.98 nm，得到單層脂質膜的共振角位移約為ΔθSPR=0.380。脂質膜是由兩層磷脂分子構成的，所以單層磷脂分子的厚度大約是1.99 nm。根據方程式（2），可以計算單層磷脂分子的共振角位移為ΔθSPR=0.190，進一步計算覆蓋在傳感芯片上的磷脂分子層的數量。這對脂質體制備條件的探索提供了很好的理論依據。

3? 實時檢測分子相互作用的變化

表面等離體激元共振是一種允許實時對生物分子進行動力學和平衡結合情況檢測的物理光學技術。首先將探針分子固定在傳感器表面，然后將目標結合相溶液流過表面。探針分子和目標分子的相互作用將會改變金屬表面的折射率，繼而改變穿過金屬傳感器的表面等離體的性質。

兩種生物大分子相互作用的過程中，有一種分子主動尋找與之相互作用的另外一種分子。相互作用主動方的分子被稱為配體（ligand），被動方的分子被稱為受體（receptor）。SPR傳感器應用于實時檢測相互作用的兩種分子在金膜上的吸附與結合，先將親和反應的一對分子中一種分子固定在金膜表面，另一種分子以溶液形式通過金膜表面時，二者的反應會引起金膜表面附近的折射率的改變，反應的傳感圖如圖3所示。曲線部分分別表示分子相互作用中結合、解離和再生過程。

假設固定的配體L與注射通過的分析物A（受體）兩種分子相互作用，形成復合體AL，這是個可逆反應式（3），符號ka和kd分別是復合體的合成速率和解離速率。

用兩種分子的相互作用的結合信號曲線圖擬合，而解離信號曲線的擬合可以得到kd的值，由此可以得到結合速率常數ka和解離速率常數kd。進而得到解離平衡常數和親和力平衡常數的值。

4? 結? 論

此外，本章對表面等離體激元共振傳感器的應用方法進行了詳細分析。以三層薄膜Kretschmann結構系統為模型，討論了SPRi系統應用于檢測樣品折射率的原理，得出折射率與SPR共振角的關系，以此可以根據檢測的SPR共振角來獲取相應的樣品折射率，了解材料的光學性能參數等。另外，闡述了當前越來越受關注的生物膜樣品厚度分布檢測和覆蓋密度檢測的原理和方法。最后，對實時分子相互作用檢測方面進行了理論推導和分析。討論了分子相互作用的結合、解離速率及平衡常數的推導，為后面SPRi系統的應用研究提供相應的理論基礎。

參考文獻：

[1] OLARU A，BALA C，JAFFREZIC-RENAULT N，et al. Surface Plasmon Resonance （SPR） Biosensors in Pharmaceutical Analysis [J].Critical Reviews in Analytical Chemistry，2015，45（2）：97-105.

[2] NGUYEN H H，PARK J，KANG S，et al. Surface Plasmon Resonance：A Versatile Technique for Biosensor Applications [J].Sensors，2015，15（5）：10481-10510.

[3] HEARTY S，LEONARD P，MA H. Measuring Antibody-Antigen Binding Kinetics Using Surface Plasmon Resonance [J].Antibody Engineering，2018，1827：421-455.

[4] YU X B，XU D K，CHENG Q. Label-free detection methods for protein microarrays [J].Proteomics，2006，6（20）：5493-5503.

[5] KANDA V，KITOV P，BUNDLE D R，et al. Surface Plasmon Resonance Imaging Measurements of the Inhibition of Shiga-like Toxin by Synthetic Multivalent Inhibitors [J].Analytical Chemistry，2005，77（23）：7497-7504.

[6] LEE H J，YAN Y L，MARRIOTT G，et al. Quantitative functional analysis of protein complexes on surfaces [J].The Journal of Physiology，2005，563（1）：61-71.

[7] HOMOLA J. Surface Plasmon Resonance Sensors for Detection of Chemical and Biological Species [J]. Chemical Reviews，2008，108（2）：462-493.

[8] HOMOLA J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors [J].Analytical and Bioanalytical Chemistry，2003，377：528-539.

[9] KANDA V，KARIUKI J K，Harrison D J，et al. Label-Free Reading of Microarray-Based Immunoassays with Surface Plasmon Resonance Imaging [J].Analytical Chemistry，2004，76（24）：7257-7262.

[10] KIM S A，BYUN K M，KIM K，et al. Shuler，S J Kim.Surface-enhanced localized surface plasmon resonance biosensing of avian influenza DNA hybridization using subwavelength metallic nanoarrays [J/OL].Nanotechnology，2010，21（35）：（2010-08-09）.https：//iopscience.iop.org/article/10.1088/0957-4484/21/35/355503.

[11] GOODRICH T T，LEE H J，CORN R M. Direct Detection of Genomic DNA by Enzymatically Amplified SPR Imaging Measurements of RNA Microarrays [J].Journal of the American Chemical Society，2004，126（13）：4086-4087.

[12] GOODRICH T T，LEE H J，Corn R M. Enzymatically Amplified Surface Plasmon Resonance Imaging Method Using RNase H and RNA Microarrays for the Ultrasensitive Detection of Nucleic Acids [J].Analytical Chemistry，2004，76（21）：6173-6178

[13] SMITH E A，THOMAS W D，KIESSLING L L，et al. Surface plasmon resonance imaging studies of protein-carbohydrate interactions [J].Journal of the American Chemical Society，2003，125（20）：6140-6148.

作者簡介：朱天逸（1999.09—），男，漢族，江蘇南京人，本科在讀，主要研究方向：生物醫學傳感器及其應用。