二苯乙烯苷對大鼠腦缺血再灌注損傷Nalp3、Caspse-1、白介素-18表達的影響

陳 雪 張嫄怡 段文彪

1.肇慶醫學高等?？茖W校病理學教研室，廣東肇慶 526020；2. 肇慶醫學高等?？茖W校學校辦公室，廣東肇慶 526020

腦缺血再灌注損傷是腦組織出現供血中斷后再恢復血流灌注時出現的病理損傷過程，其發生機制復雜，主要與鈣超載、氧化應激、能量衰竭、炎癥凋亡等有關[1]。 腦缺血再灌注損傷，破壞血腦屏障，引起大量炎癥因子釋放，損傷神經元，繼而造成腦功能障礙[2]。炎癥小體通路激活后，細胞會進行程序性死亡，細胞焦亡在腦缺血再灌注損傷的神經元損傷中越來越受重視。 二苯乙烯苷（tetrahydroxy stilbene glucoside，TSG）是中藥何首烏中主要的水溶性生物活性成分，具有降血脂、抗炎、抗氧化、抗動脈血管硬化、抗衰老和神經保護等作用。 目前對TSG 在腦缺血再灌注損傷動物模型中的研究主要是通過清除自由基、 抗氧化、抑制細胞鈣超載等來保護腦神經元細胞，影響神經細胞凋亡，發揮神經保護作用。 本研究通過建立腦缺血再灌注損傷動物模型， 探索TSG 對受損的海馬組織Nalp3、Caspase-1 及IL-18 表達的影響， 探究TSG 抗炎癥反應的腦保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

mRNA 提取試劑盒和DNA Marker（天根生化科技有限公司），逆轉錄試劑盒和PCR 反應體系（莫納生物科技有限公司），引物（武漢金開瑞生物工程有限公司），TSG（上海士鋒生物科技有限公司，批號：178031025），PCR 擴增儀（上海力康生物醫療科技有限公司，T960A），瓊脂糖水平電泳槽（北京六一生物科技有限公司，DYCP-31DN），凝膠成像系統（上海天能科技有限公司，Tanon4100）。 實驗所需的儀器由肇慶醫學高等?？茖W?？蒲衅脚_提供。

1.2 實驗分組及模型的制備

健康雄性SD 大鼠，SPF 級，2月齡，體重（200±10）g，購買于廣東省醫學實驗動物中心[許可證號SCXK（粵）2013-0001]，飼養環境溫度22～25℃，濕度約55%，明暗交替時間為12 h/12 h，自由攝食，適應性飼養一周。 大鼠隨機分為5 組，即假手術組、模型組、TSG 低劑量組、TSG 中劑量組、TSG 高劑量組，每組12 只。 大鼠術前禁食12 h，不禁水。

采用夾閉雙側頸總動脈制備腦缺血再灌注損傷模型。 用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，仰臥固定，備皮，手術區域常規消毒后沿頸部正中線作一縱形切開，用玻璃分針小心鈍性分離雙側頸總動脈，用微動脈夾夾閉雙側頸總動脈2 h 后，取下動脈夾恢復血流再灌注，縫合皮膚，傷口抗感染處理。假手術組接受相似的手術操作，但不夾閉雙側頸總動脈。 TSG 低、中、高劑量組缺血再灌注后30 min 開始腹腔注射給藥，劑量分別為30、60、90 mg/kg、，連續給藥7 d，每天給藥一次。 假手術組、模型組均采用相同的給藥方式給予等劑量的生理鹽水。本研究已經過肇慶醫學高等?？茖W校實驗動物倫理委員會審核通過。

1.3 腦組織含水的測定

術后第8 天，每組隨機選取4 只大鼠，麻醉，斷頭取腦，舍棄小腦及腦干等，稱量腦濕重量，其后把已包裹錫紙的腦組織放于烘箱中烘干48 h 后， 取出再次稱量腦重量為干重，計算腦組織含水量，腦組織含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.4 大鼠腦組織HE 染色

大鼠麻醉仰臥固定后， 用4%多聚甲醛進行心臟灌注，取出腦組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h，取材，脫水，透明，石蠟包埋，常規切片HE 染色，光學顯微鏡觀察各組大鼠腦組織形態學的變化。

1.5 RT-PCR 檢測大鼠海馬Nalp3 mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-18 mRNA 的表達

PCR 反應體系（參考PCR 說明書）：Taq Master Mix 25 μl，上下游引物各1 μl（0.4 μmol/L），模板DNA 0.4 μg，加DEPC 水補至50 μl。 PCR 反應條件：預變性94℃，2 min，變性94℃，30 s，退火55～65℃，30 s，延伸72℃，1 min，終延伸72℃，5 min（30 個循環）。 Nalp3 引物序列：正向5′-GAGGAGTGGATAGGTTTGCTG-3′，反向5′-TGGGTGTGACGTCTGTTGAG-3′；Caspase-1 引物序列：正向5′-ACCGAGTGGTTCCCTCAAGT-3′，反向5′-CGTGTACGAGTGGGTGTTTTC-3′；IL-18 引物序列：正向5′-GGCTGCCATGTCAGAAGAAG-3′，反向5′-GCTCCGTATTACTGCGGTTGT-3′。 PCR 反應產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測， 用全自動圖像分析儀分析電泳結果。

1.6 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件進行數據分析， 計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析， 組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗；以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 五組大鼠海馬組織的形態學改變

假手術組大鼠海馬區的神經細胞排列整齊致密，形態正常，呈橢圓形，染色勻稱，核膜清晰，淺藍紫色的胞核，可見顯著的核仁。 模型組大鼠海馬可見明顯的神經細胞凋亡，染色變深，細胞核不明顯，核質混為一體。 TSG 低劑量組模型組大鼠海馬可見大部分神經細胞體積縮小，細胞核染色變深，核固縮明顯，神經細胞病理性損傷改善不明顯。 TSG 中劑量組模型組及TSG 高劑量組海馬組織較模型組的神經細胞損傷程度明顯減輕，只見少部分核固縮的改變（圖1，封三）。

2.2 五組大鼠腦組織含水量的測定

五組大鼠的腦組織含水量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組及TSG 低、中、高劑量組大鼠的腦組織含水量高于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）；TSG 中、 高劑量組大鼠的腦組織含水量低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

表1 各組大鼠腦組織含水量的變化（±s）

表1 各組大鼠腦組織含水量的變化（±s）

注 與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；TSG：二苯乙烯苷

組別 n 腦含水量（%）假手術組模型組TSG 低劑量組TSG 中劑量組TSG 高劑量組F 值P 值44444 75.247±2.118 83.981±2.750a 82.306±2.462a 80.120±2.278ab 79.116±2.245ab 7.841＜0.001

2.3 五組大鼠海馬區Nalp3 mRNA、Caspse-1 mRNA、IL-18 mRNA 表達的比較

五組大鼠海馬區的Nalp3 mRNA、Caspse-1 mRNA、IL-18 mRNA 表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）； 模型組大鼠海馬區內Nalp3 mRNA、Caspse-1 mRNA、IL-18 mRNA 表達水平高于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）。TSG 中、高劑量組大鼠海馬Nalp3 mRNA、Caspse-1 mRNA、IL-18 mRNA 表達低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 各組大鼠海馬區Nalp3 mRNA、Caspse-1 mRNA、IL-18 mRNA表達的結果（±s）

表2 各組大鼠海馬區Nalp3 mRNA、Caspse-1 mRNA、IL-18 mRNA表達的結果（±s）

注 與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；TSG：二苯乙烯苷；IL-18：白介素-18

組別 n Nalp3 mRNA Caspse-1 mRNA IL-18 mRNA假手術組模型組TSG 低劑量組TSG 中劑量組TSG 高劑量組F 值P 值44444 0.958±0.035 1.243±0.050a 1.186±0.057a 1.111±0.053ab 1.040±0.048ab 21.188＜0.001 0.832±0.034 0.991±0.048a 0.968±0.046a 0.927±0.039ab 0.900±0.038ab 8.983＜0.001 0.824±0.041 1.153±0.054a 1.088±0.052a 1.059±0.051ab 1.029±0.051ab 24.771＜0.001

3 討論

缺血性腦病的發病率、致殘率、死亡率逐年升高，嚴重危害老年人的生活質量甚至是生命，腦缺血會導致缺血區域相應的功能障礙，目前治療腦缺血的主要方法是恢復血流灌注[3]。 腦缺血再灌注可通過炎癥反應、凋亡、氧化應激等多種損傷機制造成神經細胞不可逆性損傷、腦水腫，其發病機制復雜及未明確，而且目前尚未有有效的治療方案避免腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷與炎癥反應引起的細胞焦亡密切相關，各類炎癥因子（IL-18、IL-1β 等）的活化參與了細胞焦亡過程。 細胞焦亡屬于炎癥程序性細胞死亡，細胞體積不斷增大，細胞膜破裂，細胞內容物釋放，產生大量的促炎癥因子，導致劇烈的炎癥反應。 細胞焦亡既可引起細胞的死亡，也可引起組織損傷的級聯反應[4]。 細胞焦亡是由Caspse-1 介導的，與炎癥反應有關的細胞程序性死亡。炎癥因子的過度釋放及伴隨繼發性的炎癥反應是腦缺血再灌注損傷惡化的其一重要原[5]。腦缺血再灌注后，受損的細胞功能不但難以恢復，而且，還可激活因缺血產生的炎癥因子和過氧化物，導致細胞產生更嚴重的損傷或者死亡。 通過抑制Caspse-1 的表達來抑制細胞焦亡的發生，減輕缺血再灌注損傷，為治療缺血再灌注損傷提供新途徑。

目前，越來越多的研究發現腦缺血再灌注損傷與神經細胞內的炎癥反應密切相關[6]。 Nalp3 炎癥小體在腦缺血再灌注損傷神經細胞的損傷中起著重要的作用。 Nalp3 炎癥體是研究比較透徹的炎癥復合體。Nalp3 參與炎癥性疾病， 應激性疾病及免疫性疾病的發生發展[7]。 Nalp3 炎癥體是細胞內的一種模式識別受體，是炎癥反應的始動因子，在激發及調節炎癥反應中具有重要的調控功能，可誘導腦缺血再灌注損傷發生炎癥反應， 從而引起神經細胞的損傷及細胞焦亡。Nalp3 在識別危險信號的過程中被激活，招募轉接蛋白ASC 及Caspse-1 組裝成Nalp3 炎癥復合體，從而激活Caspse-1， 激活下游IL-1β 前體及IL-18 前體， 進而引起炎癥瀑布反應。 在正常的生理狀態下，Nalp3 炎癥體處于抑制狀態，但容易被激活。當腦缺血再灌注時，會發生氧化應激、鈣超載、自由基損傷、微循環障礙等，這些危險信號都可被Nalp3 識別，激活Nalp3 炎癥體， 誘導腦缺血再灌注損傷的炎癥反應。Nalp3 炎癥小體的活化與腦缺血再灌注損傷的損傷緊密相關[8]。 腦缺血再灌注損傷的大鼠腦組織內的炎癥反應升高， 減少炎癥反應可減輕腦缺血再灌注損傷的損傷程度[9]。 腦缺血時，腦細胞的代謝障礙，能量生成減少，腦細胞出現損傷甚至是死亡。 在本研究中發現模型組大鼠大腦海馬神經細胞的損傷嚴重，細胞體積縮小，可見明顯的核固縮的改變，海馬中的炎癥因子Nalp3、Caspse-1、IL-18 表達升高， 腦缺血再灌注損傷與炎癥反應有關。 腦缺血再灌注時，可激活炎癥因子，誘發大腦神經細胞的細胞焦亡程序，導致腦細胞死亡[10]。

TSG 是何首烏中的水溶性生物活性有效成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗血脂、神經保護等多種藥理作用[11]。 TSG 與白藜蘆醇具有相似的結構，僅在二位多一個酚羥基，都屬于二苯乙烯類。 白藜蘆醇可通過抑制Nalp3 炎癥小體活化后沉默調節蛋白1依賴的自噬活動來改善腦缺血再灌注損傷[12]。 在大鼠大腦中動脈閉塞模型中， 病變側大腦半球Nalp3、Caspse-1、IL-1β 和IL-18 表達上升，并上調自噬活動，減輕腦缺血再灌注損傷中Nalp3 炎癥小體引起的炎癥反應，下調自噬，減少腦梗死體積、腦水腫減輕[13]。孫玉潔等[14]研究證實白藜蘆醇可通過提高大鼠腦組織小膠質細胞的Nalp3 炎癥小體、Caspase-1 水平，降低閉鎖小帶蛋白-1 的水平， 抑制腦缺血再灌注過程中的細胞焦亡，從而保護腦功能。TSG 在關節炎、腸道炎癥及脂肪性肝炎中具有良好的抗炎作用[15]。 IL-18在感染性疾病和慢性炎癥反應中具有重要的作用[16]。IL-1β 和IL-18 表達升高，可誘導受損傷局部聚集更多的炎癥細胞，加重腦組織損傷[17]。 本實驗研究中，通過制備腦缺血再灌注損傷動物模型， 給予TSG 腹腔注射干預，發現TSG 中高劑量可減輕腦水腫，降低腦缺血再灌注損傷大鼠海馬組織中的Nalp3、Caspse-1、IL-18 的表達，提高抗炎能力，從而減輕腦缺血再灌注損傷。TSG 能降低Nalp3、Caspse-1 以及IL-18 的表達，減輕炎癥級聯反應。 王齊等[18]研究發現TSG 可上調腦缺血再灌注沙鼠腦內B 淋巴細胞瘤-2 基因（Bcell lymphoma-2，Bcl-2）水平，降低P53 和Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）水平，以調節線粒體膜上鈣離子的內流來維持完整的線粒體膜，調控氧化應激反應，改善神經細胞凋亡，保護神經細胞。TSG 可抑制小膠質細胞促炎因子的釋放，抑制小膠質細胞的活化，減輕炎癥損傷作用[19]。 TSG 能通過抑制腦缺血再灌注損傷的腦組織氧化應激蛋白煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4 以及凋亡相關蛋白Caspase-3/9 的表達發揮腦神經細胞的保護作用[20]。 TSG可通過抗炎癥反應、抗氧化應激損傷、抗凋亡等多種途徑發揮其對腦缺血再灌注損傷的神經保護作用。

綜上所述，TSG 可抑制炎癥因子Nalp3、Caspse-1、IL-18 表達，減少炎癥因子的活化，減輕炎癥損傷反應，抑制神經細胞焦亡，具有神經保護作用。TSG 可通過多種途徑發揮對腦缺血再灌注損傷的神經細胞保護作用，這需要我們更深入的研究，為腦缺血再灌注損傷的防治提供新的方案。