體素內不相干運動(IVIM)和血氧水平依賴(BOLD)評估兔肝熱缺血再灌注損傷：與CT灌注成像(CTPI)對照研究

張鈺玲，徐璐，蔣嘉炳，褚志強，李蓓，季倩

肝臟熱缺血再灌注損傷(warm ischemia reperfusion injury,WIRI)是指肝臟的血液供應出現阻礙時，組織代謝供需失衡導致缺氧，當血供重新建立、氧氣恢復后，反而引起嚴重炎癥反應和繼發性損傷的現象[1,2]。在肝移植、肝部分切除術等外科手術中都可能會出現不同程度的WIRI，其不僅影響術后肝再生，還可能誘發嚴重的術后并發癥，如肝功能甚至多器官系統功能衰竭，與患者預后密切相關[3]。因此，早期、準確判斷WIRI的存在及其程度具有重要意義。

肝臟活檢因其侵襲性、不利于持續監測等原因不能成為常規檢查方法,而影像學技術在無創評估肝缺血再灌注損傷方面的優勢顯著。CT灌注成像(CT perfusion imaging，CTPI)已被證明能夠無創定性定量評估肝臟血流灌注情況[4]，并且可以區分梗死區與非梗死區[5]；但CTPI存在輻射暴露，且外源性對比劑存在腎毒性，其應用受到限制。MRI無輻射，具有良好的應用前景，其中體素內不相干運動(intravoxel incoherent motion,IVIM)通過分析多b值反映信號衰減，將微循環灌注與純水分子擴散區分開，從而反映組織中單純水分子的擴散或灌注狀態[6]。褚志強等[7]證實了IVIM評估不同程度WIRI的可行性及診斷價值。血氧水平依賴((blood oxygen level dependent，BOLD)技術利用自身脫氧血紅蛋白作為內源性對比來反映血氧、血流量和血容量的變化[8]。Jiang等[9]發現表觀自旋-自旋弛豫率(R2*)有助于表征兔肝WIRI的早期變化和確定其嚴重程度。但目前關于IVIM、BOLD和CTPI的對照研究未見報道。因此，本研究擬通過應用IVIM和BOLD評估肝WIRI的微循環和血流動力學改變情況，并與CTPI進行比較，以評價其診斷價值。

材料與方法

1.實驗對象及動物模型的建立

本研究經院倫理委員會批準，并按照機構指南進行。選取成年雄性新西蘭大白兔30只，體重2.5～3.0 kg，實驗前禁食12 h，禁水4 h。據熱缺血時間(40 min、60 min)不同，隨機分為實驗組(G1組、G2組)和對照組(G0組)，每組10只。稱重后以5%水合氯醛(2 mL/kg)靜脈注射及腹腔浸潤聯合麻醉，麻醉后腹部脫毛、剖腹。實驗組分別夾閉肝右葉的肝動脈及門靜脈血流40 min、60 min后，去掉血管夾，關閉腹腔，恢復灌注，6 h后行IVIM、BOLD及CTPI檢查。對照組僅行剖腹手術和肝韌帶剝離術而不阻斷血流。

2.MR序列及參數

采用3T MR(Magnetom Trio Tim，Siemens Healthcare，Germany)掃描儀對實驗兔進行掃描，實驗前用陸眠靈(0.2 mL/kg)肌肉注射麻醉，仰臥放置于32通道體部相控陣線圈中心，再用腹帶及沙包輔助以減少呼吸運動。①常規掃描：軸面T1加權采用自旋回波(SE)序列，軸面T2加權采用快速自旋回波(FSE)序列。②IVIM采用單次激發回波平面成像(SS-EPI)序列進行掃描，參數TR/TE 1000 ms/57.2 ms，體素1.9 mm×1.9 mm×4.0 mm，FOV 180 mm×180 mm，帶寬1184，層數9，層厚4 mm，矩陣128×128，NEX 3。取11個b值(0,20,40,60,80,100,150,200,400,600,800 s/mm2)，總檢查時間為2 min。③BOLD應用梯度回波(GRE)序列，成像參數TR 75 ms，TE 2.57～24.25 ms (9個回波)，翻轉角30°，體素2.0 mm×1.6 mm×4.0 mm，FOV 300 mm×225 mm，矩陣192×154，層數18，層厚4 mm，總檢查時間為1 min16 s。

3.CTPI參數

MR檢查后，采用640層CT (Toshiba Aquillion One，Japan)掃描儀進行掃描，掃描前以0.2 mL/kg的劑量肌肉注射陸眠靈行麻醉處理。仰臥位放置，并用腹帶及沙包輔助降低呼吸運動影響，將耳緣靜脈處放置的26G留置針與高壓注射器連接，先進行常規平掃(管電壓80 kV，管電流50 mAs，掃描野220 mm，層厚5 mm)，再用電影模式對全肝行軸面動態掃描(管電壓80 kV，管電流75 mAs，掃描野220 mm，層厚0.5 mm)。延遲3 s后經高壓注射器注入碘普羅胺(碘濃度370 mg/mL，1 mL/kg，0.5 mL/s)，打藥結束后用10 mL生理鹽水沖洗，總掃描時間70 s。

4.圖像后處理

①將IVIM的多b值數據發送至Siemens Post Proc. Evaluation軟件，自動獲取灌注相關擴散系數(Dfast)和灌注分數(PF)圖像。②BOLD經Image J軟件(NIH,Bethesda,MD,USA)處理后自動生成有效橫向弛豫(T2*)偽彩圖，記錄相應圖像上的T2*值，取平均值，表觀自旋-自旋弛豫率(R2*)值由公式R2*=1/T2*值計算獲得。③將CTPI圖像傳至Toshiba Vitrea工作站，自動生成肝動脈灌注量(hepatic arterial perfusion,HAP)、肝門靜脈灌注量(hepatic portal perfusion，HPP)和肝動脈灌注指數(perfusion index，PI)圖像，其中PI由公式PI=HAP/(HAP+HPP)計算獲得。④數據測量時肝實質內感興趣區(region of interest，ROI)的選取(圖1)：在肝右后葉勾畫圓形或橢圓形ROI，選取時盡量避開靠近邊緣或有大血管的區域，盡量相同位置，且大小相近。選取肝實質中間連續的3個層面，每個層面勾畫3個ROI，取9個ROI的平均值。

圖1 ROI放置示意圖。a)T2WI橫斷面；b)IVIM序列b=0時橫斷面。

表1 對照組與實驗組間各參數匯總

5.實驗室檢查

掃描后，采集實驗兔靜脈血。利用全自動生化分析儀(東芝，型號TAB-40F2)檢測血清谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)含量，用于評價肝功能。隨后以空氣栓塞法處死實驗兔，取新鮮肝組織凍存。利用分光光度儀檢測凍存肝組織丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)水平。將新鮮肝組織去除包膜后切成1 cm3小塊，用10%甲醛固定，石蠟包埋，制成切片，用蘇木素-伊紅(HE)法進行染色，置于光學顯微鏡下觀察。

6.統計分析

結 果

1.對照組與實驗組間各參數的比較

多組間Dfast、PF、R2*、HAP、HPP、PI差異均有統計學意義(P均<0.05，表1)；且隨著熱缺血時間延長，Dfast和PF降低，R2*、PI升高，HAP、 HPP先升高再減低 (表2，圖2)。

表2 IVIM、BOLD、CTPI參數的相關性分析

兩兩比較顯示，Dfast、PF、HAP、PI：G0組與G1組，G0組與G2組間差異均具有統計學意義(P均<0.05)。R2*：G0組與G2組間的差異性顯著(P<0.05)。HPP：G0組與G1組，G1組與G2組間差異均具有統計學意義(P<0.05，圖2)。

圖2 a～f分別為參數Dfast、PF、R2*、HAP、HPP、PI的G0、G1、G2組間比較小提琴圖。*P<0.05，** P<0.001。隨著缺血時間延長，Dfast和 PF降低，R2*、PI升高，HAP、HPP先升高再減低。

2.IVIM、BOLD與CTPI各參數相關性分析

相關性分析顯示，Dfast與PI呈負相關，PF與PI、HAP呈負相關(P<0.05)。R2*與CTPI各參數之間均無相關性(P>0.05)。

3.IVIM、BOLD、CTPI參數與生化指標之間的相關性分析

Dfast、PF均與ALT、AST呈負相關，與SOD呈正相關；Dfast與LDH呈負相關(P<0.05)。R2*與ALT、AST呈正相關(P<0.05)。HAP、PI與ALT、AST、SOD呈正相關，HAP與LDH呈正相關，PI與MDA呈正相關(P<0.05)，見表3。其余各參數間均無相關性(P>0.05)。

表3 各參數與生化指標的相關性分析

4.IVIM、BOLD與CTPI診斷效能的比較

評價有無WIRI時，IVIM、BOLD、CTPI 的AUC分別為0.989、0.757、0.951，其中IVIM與CTPI間差異無統計學意義(P>0.05), 且IVIM的診斷效能最高。評價肝WIRI程度時，IVIM、BOLD、CTPI的AUC分別為 0.778、0.654、0.963，其中IVIM與CTPI間差異無統計學意義(P>0.05)，且IVIM的診斷效能高于BOLD(表4、5、圖3)。

圖3 各參數ROC曲線分析。a) IVIM、BOLD、CTPI診斷WIRI的ROC曲線分析；b) IVIM、BOLD、CTPI診斷WIRI程度的ROC曲線分析。

表4 IVIM、BOLD、CTPI診斷有無WIRI的ROC曲線分析

表5 IVIM、BOLD、CTPI診斷WIRI程度的ROC曲線分析

討 論

肝WIRI是一個多細胞、多因子、多介質共同參與的動態過程，涉及一系列肝臟微環境的改變，對肝臟手術患者術后恢復意義重大。CTPI和MRI反映肝臟血流灌注各有優缺點。CTPI能夠動態監測肝WIRI后肝臟血流動力學變化[5,10]，但其固有的對比劑和電離輻射問題始終不可忽視。近年來，多參數MRI[11]逐漸用于評估WIRI。Yang等[12]發現MRI可以反映發生肝WIRI時的病理生理變化過程及微循環、灌注的改變。但目前關于IVIM、BOLD和CTPI的對照研究未見報道。本研究首次對比IVIM、BOLD及CTPI評價不同程度(40 min，60 min)肝WIRI的微循環及血流動力學變化情況，并比較其診斷效能。本研究結果發現，無論是評價有無肝WIRI還是判斷其程度，IVIM診斷效能均高于BOLD，且IVIM與CTPI的診斷效能之間均無統計學差異，提示IVIM更適合常規應用于臨床，以無創監測肝WIRI的微循環改變情況。

本研究結果顯示對照組與實驗組間IVIM、BOLD及CTPI各參數差異均具有統計學意義，與既往研究結論[5,11]一致。組間比較顯示實驗組的Dfast及PF值均低于對照組，且隨著熱缺血時間延長均呈逐漸下降趨勢，原因可能是隨著損傷加重，肝細胞水腫、炎癥介質浸潤、纖維增生等變化引起肝血竇阻塞，血液輸送受阻，血流量減低，導致Dfast、PF值減小。有研究曾提出Dfast值與毛細血管平均血流速度有關[13]，本研究提示Dfast值在一定程度上可以反映WIRI時毛細血管血流的狀態。熱缺血會引起肝臟局部微環境閉塞、組織灌注減少，進而導致局部體素的磁敏感性發生改變，去氧血紅蛋白分數增加，R2*值隨之增加，從而很好地表征肝損傷后局部組織的含氧水平。缺氧引起Kupffer細胞釋放氧自由基、炎癥因子，動脈緩沖效應(HABR)[14]被激活，小動脈及小門靜脈通透性增加；且肝竇阻塞使血管阻力增加，腺苷堆積，誘導血管舒張，HAP、HPP、PI增加；隨著WIRI加重，代謝產物堆積，HABR緩沖能力下降，加之肝內門體分流開放[5]，HPP減少，肝動脈通過血流量的改變緩沖門脈血流下降，因此HAP無明顯下降，PI仍呈增加趨勢。

本研究顯示Dfast與PI相關性較低，與Guo等[13]的研究結果一致。Cohen等[15]提出使用低b值較少可能會導致對灌注的低估，因此為了提高PF與Dfast擬合的準確性[16]，本研究采用8個200 s/mm2以下的b值。此外呼吸運動偽影和圖像低信噪比可能也有一定的影響。Dfast與PF均能反映灌注信息，但強調不同方面：Dfast與毛細血管流速相關[13]，而PF表示的是毛細血管血流占組織血流的容積分數，代表毛細血管的豐富程度[17]。研究[18]表明PF與CTPI得到的血容量具有良好的相關性，本實驗中PF與HAP、PI相關，證實PF能夠反映毛細血管的灌注量。血氧水平、鐵含量[19]、血流量和血容量都能影響R2*值，單純BOLD可能并不能很好地區分局部組織氧合與灌注狀態，因此導致本研究中R2*值與CTPI各項參數均無相關性。

肝臟的酶學指標 ALT、AST、LDH能夠提示肝細胞的損傷程度，尤其是ALT[20]。過氧化反應產物MDA積累會加劇細胞膜的損傷，MPO在機體炎癥反應中發揮作用，SOD主要參與在機體氧化/抗氧化的平衡調節，可以清除機體多余的氧自由基。再灌注時，肝組織代謝障礙導致SOD合成不足，氧化/抗氧化失衡、氧自由基清除障礙，引發脂質過氧化物反應，導致MDA積累，但由于缺氧階段自由基產生較少，MDA生成也不會太多。本研究結果顯示多個IVIM、BOLD及CTPI參數與生化指標具有較好的相關性，提示IVIM、BOLD及CTPI不僅能敏感地反映肝細胞的損傷程度，還能較好地表征肝功能的變化及組織抗氧化能力，并且也可以提示不同熱缺血程度時微循環變化。

本研究存在一些局限性。①每組實驗兔數目較少。②掃描過程中因實驗兔無法憋氣，可能對實驗結果的測量和圖像質量存在一定影響。③能夠反映肝血流灌注信息的MRI技術不只IVIM、BOLD，未來應進一步探索更多MRI序列的應用。④肝WIRI本質上是一個動態過程，具有時間依從性，而本研究僅在特定時間框架內進行的，有待進一步縱向研究以揭示其演變過程。

因此，與CTPI相比，IVIM能無創、較好反映肝WIRI時肝組織微循環和血流動力學變化情況，有望臨床應用時取代CTPI。