C60-IONP-GE11納米粒對乳腺癌細胞的體外成像及光動力學研究

符舒琦，涂蓉，劉夢嬋，洪雅敏，李韓建，尤曉光

癌癥已成為當前世界威脅人類健康和生命的嚴重疾病之一[1]。如何早期診斷并治療腫瘤是分子影像學研究熱點之一。磁性氧化鐵納米粒子(iron oxide nanoparticles，IONP)是一種多功能磁性納米材料，當其粒徑在5～100 nm時具有超順磁性，可作為磁共振成像(MRI)、生物催化活性(納米酶)以及藥物遞送等多功能的診療工具，IONP合成相對簡單、生物相容性好，可以對其進行進一步的表面修飾，增加水溶性并偶連靶向分子，因此可用于腫瘤磁共振顯像及治療[2-3]。C60(fullerene，富勒烯)有著獨特的物理化學性質，是近年來被廣泛用作腫瘤光動力治療(photodynamic therapy，PDT)的光敏劑[4-5]。GE11(氨基酸序列YHWYGYTPQNVI)是首個對表面生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)具有高親和力的人工合成小分子多肽[6]。EGFR受體高表達于上皮源性腫瘤細胞，與人類多種癌癥的發生發展密切相關[7]。PDT是指通過特定波長的激光照射靶組織使其產生單線態氧、羥基自由基、過氧化氫等活性氧(reactive oxygen species，ROS)物質[8]。本研究化學合成C60-IONP-GE11靶向多功能MRI對比劑(圖1)，觀察其體外對乳腺癌細胞EGFR靶點靶向成像及PDT治療作用，為后續體內實驗奠定前期實驗基礎。

材料與方法

1.材料和設備

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231來源于國家實驗細胞資源共享平臺；靶向小肽GE11(QKYHWYGYTPQNVIQK)和隨機小肽(random peptide，RP)(TQRKGKTHRKPHKTKT)由上海吉爾多肽有限公司合成。相關試劑和試劑盒：FBS、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、0.25%胰酶、Cy3標記山羊抗兔IgG(H+L)、增強型CCK-8試劑盒、ROS檢測試劑盒(Beyotime Biotechnology)；DMEM高糖培養基、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合液(索萊寶)；Annexin-V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(杭州聯科生物)。設備采用激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000，日本)，3.0T MRI和膝關節線圈(Siemens，德國)，多功能酶標儀(SynergyHTX，美國)，532 nm激光器(Oxlasers，上海)。

2.方法

①驗證EGFR高表達腫瘤細胞株：免疫熒光染色：取人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)接種于共聚焦培養皿中(1×105個/培養皿)，37℃，5% CO2孵育24 h。4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗；加入500 μL染色封閉液封閉30 min；吸掉封閉液后培養皿內滴加足量1:200稀釋的一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜后加入比例為1：500稀釋的熒光二抗，室溫孵育1 h后用PBS浸洗，加200 μL DAPI熒光染料孵育5 min進行核復染，最后吸水紙吸干皿內液體在激光共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

②體外MRI成像實驗及普魯氏藍染色實驗:體外MRI掃描：取MDA-MB-231細胞接種于6孔板(1×106個/孔)，將其隨機分為兩組：C60-IONP-GE11(實驗組)和C60-IONP-RP(非靶向隨機小肽對照組)，分別配備200 μL濃度為25、50、100、200、400 μg/mL的溶液與MDA-MB-231共孵育2 h，棄去培養液，PBS漂洗三次，細胞鏟收集孔內細胞，加入2 mL PBS 吹打重懸后加入等體積的1%瓊脂糖溶液進行MR 掃描并測量T2值。采用3.0T MR掃描儀，并選用膝關節線圈，T2加權自旋回波成像序列，參數：TR 1000 ms，TE 140 ms，視野(FOV)22 cm×22 cm，層厚0.6 mm，矩陣384×384。

普魯士藍染色法(鐵染色)：取MDA-MB-231細胞接種于爬片中，隨機將其分為兩組：C60-IONP-GE11靶向對比劑(實驗組)和C60-IONP-RP非靶向對比劑(對照組)，加入1.5 mL濃度為200 μg/mL的C60-IONP-GE11或C60-IONP-RP對比劑溶液，置于37℃，5% CO2培養環境下孵育12 h。加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS潤洗3次。普魯氏藍染色試劑盒，1:1體積比例混合鹽酸與亞鐵氰化鉀溶液細胞染色30 min后，PBS充分洗滌3次，再加伊紅染色液淡染細胞核15 min，PBS潤洗5 s后脫水透明、樹膠封固。

表1 C60-IONP-GE11實驗組和C60-IONP-RP對照組處理后的MDA-MB-231細胞的T2值

③細胞毒性實驗:將人乳腺癌細胞MDA-MB-231以5×103個/孔(100 μL/孔)接種到96孔板中，待細胞充分貼壁分別加入100 μL不同濃度梯度的C60-IONP-GE11，并按照濃度梯度分為以下7組：0 μg/mL(完全培養基空白對照組)、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL，每個濃度梯度設置無細胞的C60-IONP-GE11對比劑對照孔作為背景值，每個濃度設置5個復孔，置于37℃，5% CO2培養環境下孵育24 h；每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養箱內孵育1 h，酶標儀檢測細胞在450 nm處的吸光度(optical density，OD)，按照計算公式：細胞存活率(%)=(實驗孔OD值-實驗組背景孔OD值)/(對照孔OD值-對照組背景孔OD值)計算細胞存活率。

④體外光動力實驗：CCK8(Cell Counting Kit-8，細胞計數試劑)檢測：將人乳腺癌細胞MDA-MB-231以5×103個/孔(100 μL/孔)接種到96孔板中，每孔需間隔1個空白孔以便進行光照，置于37℃，5% CO2培養環境下孵育使其充分貼壁。實驗設置4個分組：①空白激光組(完全培養基)；②C60-IONP-GE11無激光組；③C60-IONP-RP+激光組；④C60-IONP-GE11+激光組。②③④組加入10 μL濃度為200 μg/mL的C60-IONP-GE11或C60-IONP-RP對比劑溶液，每組設置5個重復孔，37℃，5% CO2環境孵育24 h。光照：吸出培養基，PBS輕柔潤洗2次洗去未結合對比劑，①③④組暴露于532 nm，100 mW/cm2激光下照射20 min，再孵育12 h；隨后每孔加入10 μLCCK8，置于37℃，5% CO2培養箱孵育1.5 h，用酶標儀檢測450 nm處的吸光度，按公式計算細胞存活率，繪制曲線。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測：將人乳腺癌細胞MDA-MB-231以每皿1×104個接種于共聚焦培養皿中，置于37℃，5% CO2培養箱孵育24 h，實驗設置6個分組：①空白激光組(完全培養基)；②C60-IONP-GE11無激光組；③C60-IONP-RP+激光組；④200 μg/mL C60-IONP-GE11+激光組；⑤400 μg/mL C60-IONP-GE11+激光組；⑥800 μg/mL C60-IONP-GE11+激光組。按照分組加入對應溶液，每組加入50 μL比例為1:1000稀釋后的DCFH-DA探針，置于37℃，5% CO2培養箱孵育30 min，PBS洗滌3次以洗去未結合探針；①③④⑤⑥組暴露于532 nm，100 mW/cm2激光照射20 min，共聚焦顯微鏡下觀察活性氧產生情況，并使用Image J軟件對熒光結果進行半定量分析。

3.統計分析

采用SPSS 22進行統計學分析，體外細胞光動力學實驗使用Dunnett-t檢驗比較各組間差異，體外毒性實驗和Image J半定量分析熒光強度，使用Tamhane’s T2檢驗比較各組間差異。

結 果

1.C60-IONP-GE11表征

透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)可見C60-IONP-GE11形態呈類球形，大小基本一致(圖1a)，動態光散射(dynamic light scattering，DLS)測得IONP的水化直徑為(29.4±2.1)nm，C60-IONP-GE11的水化直徑為(37.7±3.2)nm(圖1b、d)，Zeta電位顯示IONP電位為(38.8±0.4)mV，C60-IONP-GE11電位為(-35.9±0.7)mV(圖1c、d)；傅氏轉換紅外線光譜分析(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)顯示，羧基富勒烯在3000 cm-1左右形成大而寬的峰，且以3000 cm-1為中心對稱，是締合羧基的吸收，1433 cm-1、1191 cm-1、525 cm-1是C60的特征峰，578 cm-1是Fe-O特征振動峰，多巴胺修飾的Fe3O4在3400 cm-1、1597 cm-1、1265 cm-1出現氨基的吸收峰，C60-IONP-GE11在3419 cm-1的吸收峰是v(-NH2)和v(-OH)的疊加，在1733 cm-1、1672 cm-1、0～1200 cm-1等出現多個酰胺鍵中強特征峰(圖2a)，綜上可以看出C60和GE11被偶聯在磁性顆粒的表面；磁滯曲線顯示C60-IONP-GE11與IONP有相似的磁飽和強度(圖2b)。

2.EGFR高表達腫瘤細胞株的篩選

免疫熒光結果顯示，DAPI染液將細胞核染成藍色，MDA-MB-231細胞膜上有大量Cy3熒光(圖3)。

圖1 C60-IONP-GE11的A)TEM;B)DLS;C)Zeta電位;D)Zeta電位統計表。 圖2 a)C60-IONP-GE11合成FTIR圖；b)IONP和C60-IONP-GE11磁化曲線。

3.體外MRI成像實驗及普魯氏藍染色實

為了評價多功能對比劑C60-IONP-GE11的靶向性和成像能力，對EGFR高表達的MDA-MB-231細胞進行體外MR成像。C60-IONP-GE11濃度為100 μg/mL時，T2WI開始出現負性強化，隨著濃度增加，T2WI信號降低，非靶向隨機小肽C60-IONP-RP對照組未見明顯負性強化(圖4)。表1示，分析實驗組與對照組濃度與T2值的相關性，結果顯示實驗組和對照組的濃度與T2值均呈負相關(R值為-0.928、-0.540，表1)，其中實驗組的相關性較對照組更強，并可得實驗組線性回歸方程為Y=145.898-30.269×X，R2=0.862。

表2 各組與實驗組對比統計表

普魯士藍染色結果顯示，C60-IONP-GE11實驗組可見細胞明顯藍染，非靶向隨機小肽C60-IONP-RP對照組未見明顯染色(圖5)。

圖3 MDA-MB-231細胞EGFR表達免疫熒光圖(激光共聚焦掃描顯微鏡下×1000，標尺為5 μm)。a)DAPI染核；b)Cy3染膜；c)明場細胞輪廓；d)核膜融合圖。 圖4 a)C60-IONP-GE11處理后的MDA-MB-231細胞的T2WI圖；b)C60-IONP-RP處理后的MDA-MB-231細胞的T2WI圖。 圖5 MDA-MB-231細胞的普魯士藍染色圖(熒光倒置顯微鏡，×1000，標尺為20μm)。a)C60-IONP-GE11處理后；b)C60-IONP-RP處理后。

4.細胞毒性實驗

為了評估對比劑C60-IONP-GE11的細胞毒性，筆者測定了不同濃度C60-IONP-GE11處理后MDA-MB-231細胞的細胞存活率。與空白組相比，C60-IONP-GE11濃度為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL時，存活率分別為(98.86±3.65)%、(96.08±4.09)%、(92.76 ±3.03)%、(90.71±3.21)%、(88.19%±1.79)%、(84.44%±2.64)%，差異有統計學意義(F=18.988，P<0.001，圖6)。

5.體外光動力實驗

為了研究C60-IONP-GE11對MDA-MB-231細胞的光動力學治療效果，測定了不同處理條件下的細胞存活率。單純激光組細胞存活率為(92.45±4.99)%，C60-IONP-GE11無激光組細胞存活率為(95.86±4.05)%、非靶向隨機小肽C60-IONP-RP對照組激光處理后細胞存活率為(83.39±3.95)%，而C60-IONP-GE11實驗組激光處理后的細胞存活率僅為(22.79±4.84)%，差異有統計學意義(P<0.001，圖7，表2)。

ROS檢測結果顯示，實驗組靶向對比劑C60-IONP-GE11+激光組處理細胞后可見細胞內有大量綠色熒光，而單純激光組、C60-IONP-GE11無激光組未見明顯綠色熒光，非靶向對比劑C60-IONP-RP+激光處理細胞后細胞內見少量綠色熒光，并且隨對比劑濃度的增加，實驗組細胞內綠色熒光增多(圖8)。對熒光染色結果進行半定量分析(圖9)，實驗組靶向對比劑C60-IONP-GE11+激光組與單純激光組、C60-IONP-GE11無激光組、非靶向對比劑C60-IONP-RP+激光組的ROS熒光強度差異具有統計學意義(F=2288.539，P<0.001)。

圖6 不同濃度的C60-IONP-GE11細胞毒性實驗。 圖7 各激光組處理后MDA-MB-231的細胞存活率及統計分析結果。A為單純激光組，B為C60-IONP-GE11無激光組，C為C60-IONP-RP激光組，D為C60-IONP-GE11激光組。 圖8 a)單純激光組；b)C60-IONP-GE11無激光組；c)C60-IONP-RP激光組；d)200 μg/mL C60-IONP-GE11+激光組；e)400 μg/mL C60-IONP-GE11+激光組；f)800 μg/mL C60-IONP-GE11+激光組處理后MDA-MB-231細胞的活性氧檢測圖(激光共聚焦掃描顯微鏡下×2000，標尺為20 μm)。

圖9 A)單純激光組；B)C60-IONP-GE11無激光組；C)C60-IONP-RP激光組；D)200 μg/mL C60-IONP-GE11+激光組；E)400 μg/mL C60-IONP-GE11+激光組；F)800 μg/mL C60-IONP-GE11+激光組處理后MDA-MB-231細胞的ROS熒光半定量折線圖。

討 論

近年來，納米材料技術的興起為癌癥的診治開辟了新前景，其中以多功能磁性納米粒子為基礎的多模式成像和癌癥協同治療已成為分子影像領域發展的新研究方向之一[9-11]。

GE11是特異性靶向上皮源性腫瘤細胞膜EGFR受體的小分子多肽，序列為YHWYGYTPQNVI[12-13]，本研究為保護小肽功能區活性，在首尾各加上兩個氨基酸，構成QKYHWYGYTPQNVIQK；GE11內化但不激活EGFR，猶如天然的表皮生長因子配體，從而避免促進腫瘤生長[6]。EGFR是位于細胞膜表面的跨膜糖蛋白[14]，過表達于各種上皮來源的腫瘤，包括非小細胞肺癌、乳腺癌、頭頸癌、胃癌、食管癌、前列腺癌、膀胱癌等[15]。免疫熒光實驗結果顯示MD-MBA-231細胞膜表面產生大量紅色熒光，表明MD-MBA-231細胞的EGFR表達量多，與文獻報道一致[16]，這是我們選擇MD-MBA-231細胞株進行體外MRI成像及PDT治療原因。

C60-IONP-GE11的TEM圖示制備的納米顆粒尺寸均一，水合粒徑約29.4 nm，當納米顆粒粒徑在10～100 nm區間時，肝脾網狀內皮系統對其的吞噬減少[17]，體內血液循環的時間延長，進一步增加了腫瘤病灶對USPIO的有效結合時間和攝入時間[18]。FTIR各峰可見C60特征峰，Fe-O峰，酰胺鍵特征峰，GE11共振峰，表明C60和GE11被偶聯在磁性顆粒的表面。飽和磁化強度隨外加磁場的變化而變化，磁飽和度約為53.4 emu/g，幾乎無磁滯現象，呈現超順磁性，可用于MRI成像。

超順磁性氧化鐵納米粒可作為磁共振成像的陰性造影劑，即在T2加權像中顯示為低信號[19]。MD-MBA-231與C60-IONP-GE11孵育后，PBS洗去未結合的對比劑，當C60-IONP-GE11在濃度為100 μg/mL時，MD-MBA-231細胞開始出現T2信號的負性強化，當濃度升至200 μg/ml時T2信號已接近背景值，隨濃度增高T2信號負性強化增強，表明C60-IONP-GE11可體對乳腺癌細胞靶向成像；普魯士藍染色實驗顯示靶向組細胞明顯藍染，而對照組未見染色。YANG等[20]用GE11肽修飾USPIO，與EGFR高表達H1299人非小細胞肺癌細胞孵育后普魯士藍染色可見細胞明顯藍染，腋下荷瘤裸鼠MR成像結果顯示，尾靜脈注射1 h后腫瘤區域T2信號明顯下降；MA等[21]開發AFP和GPC3雙抗原靶向的USPIO探針，體外對Hepa1-6小鼠肝癌細胞MR成像，顯示實驗組T2WI信號下降幅度明顯，普魯士藍染色顯示細胞明顯藍染；ZHAO等[22]合成適配體(aptamer，Apt)介導的超小超順磁性鐵納米粒子(Ultrasmall superparamagnetic iron ox-ide，USPIO)探針，MR體外T2WI成像顯示Apt-USPIO孵育的Huh-7人肝癌細胞信號強度隨對比劑濃度升高，T2信號逐漸降低，普魯士藍染色試驗觀察到Huh-7肝癌細胞對Apt-USPIO有特異性攝取；本研究與前人結果基本一致。

CCK-8試劑可被活細胞氧化還原生成可溶性的橙黃色甲瓚，因此培養液顏色的深淺與活細胞成正比，與細胞毒性成反比，通過測定反應產物的OD值即可簡便且準確的反映存活細胞的數量。本課題選用CCK8試劑盒檢測不同濃度C60-IONP-GE11對MD-MBA-231細胞存活情況的影響，結果顯示不同濃度C60-IONP-GE11處理后，隨著濃度的增加，MDA-MB-231細胞的存活率稍降低，但均在80%以上，根據細胞毒性評級標準，當細胞存活率>75%時可視為無細胞毒性[23]，故C60-IONP-GE11幾乎無毒，可用于后續光動力治療實驗。LI[24]等合成水溶性C60衍生物，在無光照條件下，80 μg/ml、150 μg/ml、300 μg/ml的水溶性C60對SMMC-7721人肝癌細胞的細胞抑制率均在10%以下；FU[25]等發現當IONP濃度為30 μg/ml時，4T1人乳腺癌細胞的細胞存活率僅下降不到10%。

光動力學治療是指用特定波長的激光照射吸收了光敏劑的靶組織，產生單線氧、活性氧殺傷病變細胞而正常細胞不受影響[26]，其發生條件有三個：適宜波長激光、光敏劑、氧氣[27]。ROS產生過多，細胞則進入氧化應激狀態，從而激發腫瘤細胞損傷、腫瘤血管破壞等殺傷效應[28-30]。PDT治療腫瘤的機制主要包括Ⅰ型反應(產生活性氧)和Ⅱ型反應(產生單線態氧1O2)[31]。C60作為一種新興的光敏劑，被廣泛應用于光動力治療，C60光動力治療更傾向于發生Ⅰ型反應產生活性氧物質[32,33]，因此細胞內活性氧水平是評價C60用于PDT治療效果的重要指標。

活性氧檢測試劑盒是一種利用熒光染料DCFH-DA進行活性氧檢測的試劑盒，無熒光的DCFH-DA進入細胞后可被活性氧氧化成有熒光的DCF，通過觀察DCF的熒光強度可檢測細胞內活性氧的生成水平，本課題通過觀察細胞活性氧生成水平來檢驗PDT治療實驗結果。單純給予光照組和單獨給與C60-IONP-GE11孵育的MD-MBA-231 細胞活性氧檢測陰性，說明這兩組無光動力學治療反應發生；而C60-IONP-RP激光組細胞活力稍下降，可能是C60-IONP-RP與MD-MBA-231 細胞發生少量非特異性結合，C60在激光作用下產生少量活性氧使細胞存活率稍降低，活性氧檢測證實了少量綠色熒光存在。與對照組相比，C60-IONP-GE11激光組細胞存活率僅為(22.79±4.11)%，細胞活力明顯下降 ，殺傷腫瘤細胞效果最顯著(P<0.05，具有統計學意義)，且活性氧檢測實驗顯示大量綠色熒光存在，而且C60-IONP-GE11濃度增加，活性氧產生增多，光動力治療效果增強，進一步證明了C60-IONP-GE11用于光動力治療腫瘤的可行性。SHI等[34]開發了C60-IONP-PEG-FA，體外光動力治療可使(73.7±1.3)%的乳腺癌細胞MCF-7發生凋亡。SHI等[35]發現15 μg/ml的C60@Au-PEG光動力治療MCF-7細胞時，可使其細胞存活率下降至(42.8±5.2)%。Yang等[20]開發Ge11-PDA-Pt@USPIOs納米粒子，GE11特異性靶向EGFR陽性細胞，激光照射后可使H1299人非小細胞肺癌細胞產生大量ROS熒光，均與本研究結果類似。

綜上所述，C60-IONP-GE11多功能MR對比劑兼具磁共振成像與光動力靶向治療作用，有望同時解決腫瘤靶向MR成像和治療的問題，具有良好應用前景。