MTHFR基因啟動子甲基化與糖尿病腎病發病的關系研究

陳靈芝，鐘開義，陳立國

糖尿病腎病是導致終末期腎功能衰竭的主要原因之一，我國2 型糖尿病患者中有20%～40%合并糖尿病腎病［1］。糖尿病腎病早期癥狀隱匿，臨床診斷主要依靠尿微量白蛋白和腎小球濾過率估算值（estimated glomerular filtration rate，eGFR），但是僅根據這兩項診斷并不準確，并非所有發生腎功能衰竭的糖尿病患者都有大量蛋白尿和eGFR下降現象［2］?；騿幼蛹谆且环N表觀遺傳機制?，F有研究發現，某些基因啟動子甲基化與糖尿病腎病發病存在一定關系，如基質金屬蛋白酶-9基因啟動子甲基化與血尿素氮、血肌酐增高有關，參與糖尿病腎病發病 過 程［3］。 亞 甲 基 四 氫 葉 酸 還 原 酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）代謝的關鍵酶，也是基因啟動子甲基化的關鍵催化酶，MTHFR基因啟動子甲基化會影響MTHFR 的活性，導致Hcy 代謝異常，血清Hcy水平升高［4］；而高Hcy血癥可增加慢性腎臟病發生風險，是2 型糖尿病患者發生腎功能不全的獨立危險因素［5］。因此，MTHFR基因啟動子甲基化可能與糖尿病腎病有關。本研究擬檢測糖尿病腎病患者MTHFR基因啟動子甲基化情況，分析其與糖尿病腎病發病和病情進展的關系，以期為相關研究提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2019 年6 月—2021 年3 月海南西部中心醫院收治的糖尿病腎病患者（腎病組）81例，包括男53例，女28 例，年齡55～75 歲，平均（65.12±6.23）歲。根據慢性腎臟病分期標準將患者分為1～2期組（26例），3a～3b期組（39例），4～5 期組（16 例）。納入標準：均為2 型糖尿病，符合2017版《中國2型糖尿病防治指南》中糖尿病腎病診斷標準；年齡＞18 周歲。排除標準：原發性腎小球腎炎、原發性腎病綜合征及先天性多囊腎；狼瘡性腎炎、紫癜性腎炎、高血壓腎病等其他繼發性腎病；腎細胞癌、腎盂癌、胚胎瘤；近6個月曾行腎臟手術者。另選擇同期收治的139例單純2型糖尿病患者（單純糖尿病組）和51例于我院門診體檢中心體檢的志愿者（對照組），其中單純糖尿病組患者符合2017 版《中國2 型糖尿病防治指南》中2型糖尿病診斷標準，單純糖尿病組和對照組均經實驗室和影像檢查排除腎臟疾病。單純糖尿病組男94例，女45例，年齡52～77歲，平均（65.79±7.91）歲；對照組男35例，女16例，年齡53～78歲，平均（65.65±6.19）歲。3組年齡（F=0.164）、性別構成（χ2=0.173）差異無統計學意義。本研究獲得我院倫理委員會批準（201812052），患者均簽署知情同意書。

1.2 甲基化特異性實時定量聚合酶鏈反應（qMSP）檢測MTHFR基因啟動子甲基化水平 所有患者入組后24 h 內（對照組體檢當日）采集肘正中靜脈血3 mL，取血清（血標本凝固后上層液）3 000 r/min離心5 min，參照文獻［6］采用qMSP法檢測血清MTHFR基因啟動子甲基化表達。Wizard?SV Genomic DNA Purification Kit 組織DNA提取試劑盒購自美國Promega生物公司，EZ DNA Methylation-Gold Kit購自美國Zymo公司，Qsep100 全自動核酸蛋白分析儀購自中國臺灣光鼎科技股份公司。采用甲基化參考百分比（percentage of methylated reference，PMR）量化甲基化水平，PMR=2-（Ct樣本-Ct內參）×100%。引物由上海捷瑞公司設計合成，引物序列：MTHFR上游5'-TAGATTTAGGTACGTGAAGTAGGGTAGAC-3'，下 游5'-GAAAAACTAATAAAAAACCGACGAA-3'；U6（內 參）上 游5'-TTTAGGTATGTGAAGTAGGGTAGATGT-3'，下 游 5'-CAAAAAACTAATAAAAAAAACCAACAAA-3'。

1.3 臨床資料收集 收集受試者年齡、性別、體質量、收縮壓、舒張壓、吸煙史（接受治療前10年內規律吸煙史，且吸煙數量累計≥100支），有無基礎疾病（高血壓、高脂血癥），合并癥（冠心病、腦梗死、視網膜病變），糖尿病病程，家族史，以及常規實驗室指標。常規實驗室指標包括三酰甘油（triacylglycerol，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、Hcy、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，SCr）、eGFR、尿微量白蛋白、空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）、空腹胰島素（fasting insulin，FINS）、糖化血紅蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）；其中，FPG、TG、TC、Hcy、BUN、SCr檢測采用東芝40 型全自動生化分析儀，FINS 檢測采用日立h7060全自動化學免疫分析儀，HbA1c檢測采用HA8160糖化血紅蛋白分析儀，尿微量白蛋白檢測采用GC-1 200 γ放射免疫計數器。

1.4 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。計數資料以例或例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。影響因素分析采用Logistic回歸分析。受試者工作特征（ROC）曲線及曲線下面積（AUC）分析MTHFR基因啟動子甲基化水平診斷糖尿病腎病的價值，三者聯合采用并聯方式即滿足各指標單獨截斷閾值判斷為糖尿病腎病。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 一般資料比較 與對照組比較，單純糖尿病組、腎病組的吸煙比例、收縮壓、舒張壓升高（P＜0.05）；與單純糖尿病組比較，腎病組高血壓和高脂血癥比例增加、收縮壓升高，糖尿病病程較長（P＜0.05），2 組吸煙比例和舒張壓差異無統計學意義，見表1。

Tab.1 Comparison of general data between the three groups表1 各組一般資料的比較

2.2 實驗室指標比較 與對照組比較，單純糖尿病組和腎病組TC、TG、FPG、FINS、HbA1c、Hcy、BUN、SCr 及尿微量白蛋白水平升高，eGFR、MTHFR基因啟動子甲基化水平降低（P＜0.05）。與單純糖尿病組比較，腎病組TG、HbA1c、Hcy、BUN、SCr、尿微量白蛋白水平升高，eGFR、MTHFR基因啟動子甲基化水平降低（P＜0.05），2組TC、FPG、FINS 比較差異無統計學意義，見表2。

Tabl.2 Comparison of laboratory indicators between the three groups表2 3組實驗室指標比較 （±s）

Tabl.2 Comparison of laboratory indicators between the three groups表2 3組實驗室指標比較 （±s）

**P＜0.01；a與對照組比較，b與單純糖尿病組比較，P＜0.05。

組別對照組單純糖尿病組腎病組F n 51 139 81 TC（mmol/L）3.81±0.74 5.28±1.53a 5.31±1.15a 30.325**TG（mmol/L）1.37±0.11 1.70±0.21a 1.85±0.25ab 98.165**FPG（mmol/L）4.35±0.52 7.33±1.05a 8.68±1.25a 32.167**FINS（U/mL）3.69±0.37 8.97±1.93a 9.12±2.33a 43.719**組別對照組單純糖尿病組腎病組F HbA1c（%）4.21±0.62 6.05±1.33a 8.90±1.72ab 105.352**Hcy（μmol/L）7.71±1.21 13.10±2.92a 18.24±4.17ab 76.287**BUN（mmol/L）6.35±1.09 13.52±2.49a 36.25±6.43ab 153.241**SCr（μmo/L）25.02±5.41 28.35±6.02a 82.43±12.52ab 161.42**組別對照組單純糖尿病組腎病組F尿微量白蛋白（mg/L）105.62±12.21 140.35±28.49a 351.35±39.41ab 206.352**eGFR［mL/（min·1.73 m2）］129.42±17.09 113.32±13.41a 80.42±6.43ab 173.460**MTHFR基因啟動子甲基化（%）17.65±3.26 12.54±2.43a 8.12±1.35ab 258.574**

2.3 不同慢性腎臟病分期患者MTHFR基因啟動子甲基化差異 1～2 期組、3a～3b 期組、4～5 期組血清MTHFR基因啟動子甲基化水平分別為（8.72±0.65）%、（8.16±0.54）%、（7.05±0.21）%，呈依次降低趨勢（F=48.504，P＜0.05）。

2.4 2型糖尿病患者發生糖尿病腎病的影響因素分析 以2型糖尿病患者是否發生糖尿病腎病為因變量（否=0，是=1），以高血壓（否=0，是=1）、高脂血癥（否=0，是=1）、糖尿病病程、收縮壓、TG、HbA1c、Hcy、BUN、SCr、尿微量白蛋白、eGFR、MTHFR基因啟動子甲基化水平為自變量。單因素Logistic 回歸分析顯示，高血壓和HbA1c、BUN、SCr、尿微量白蛋白、eGFR、MTHFR基因啟動子甲基化是2 型糖尿病患者發生糖尿病腎病的影響因素（P＜0.05），見表3。將單因素Logistic 回歸分析中具有統計學意義的變量納入多因素Logistic 回歸分析，結果顯示，高血壓和尿微量白蛋白升高是2型糖尿病患者發生糖尿病腎病的獨立危險因素（P＜0.05），eGFR和MTHFR基因啟動子甲基化水平升高是2型糖尿病患者發生糖尿病腎病的保護因素（P＜0.05），見表4。

Tab.3 Univariate Logistic regression results of diabetic nephropathy in type 2 diabetic patients表3 2型糖尿病患者發生糖尿病腎病的單因素Logistic回歸結果

2.5 ROC曲線分析 相較于單獨MTHFR基因啟動子甲基化、尿微量白蛋白、eGFR，三指標并聯檢查的診斷效能較高，敏感度和特異度較好，見圖1、表5。

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病患者最嚴重的微血管并發癥之一，是導致患者死亡和殘疾的主要原因，盡管血管緊張素轉化酶抑制劑和血管緊張素受體阻斷劑等藥物可有效減少蛋白尿和減緩糖尿病腎病進程，但是糖尿病腎病發病率仍在不斷增高［7］。高齡、病程較長、高血壓、肥胖、高血脂、高尿酸、血糖水平控制不佳等是糖尿病腎病的危險因素［8］。糖尿病相關慢性腎臟病位居我國慢性腎臟病住院人數的首位，已成為引起終末期腎病的主要原因之一［9］。目前，糖尿病腎病的診斷以尿白蛋白排泄率增加、伴或不伴eGFR 下降、動脈壓升高為標準［10］；但是感染、發熱、心力衰竭、高血壓、高血糖等因素可獨立于腎臟損害，亦可導致尿白蛋白水平增高［11］。因此，積極探尋與糖尿病腎病相關的生物學標志物十分重要。

Tab.4 Multivariate Logistic regression results of diabeticnephropathy in type 2 diabetic patients表4 2型糖尿病患者發生糖尿病腎病的多因素Logistic回歸結果

Fig.1 ROC diagram of MTHFR gene methylation combined with urinary microalbumin and eGFR in the diagnosis of diabetic nephropathy in patients with type 2 diabetes圖1 MTHFR基因啟動子甲基化、尿微量白蛋白、eGFR及聯合檢測診斷2型糖尿病患者發生糖尿病腎病的ROC曲線

基因啟動子甲基化指對DNA的直接化學修飾，其過程由DNA甲基轉移酶家族催化，該酶將甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉移至胞嘧啶殘基的第5 個碳，形成5-甲基胞嘧啶。DNA 甲基轉移酶可為未修飾的DNA 建立新的甲基化模式，在DNA 復制、胚胎的發育、細胞有絲分裂等過程中發揮關鍵作用［11］。DNA甲基化還可募集基因調控相關蛋白，促使轉錄因子與DNA 結合調節基因表達，在基因轉錄、DNA 損傷修復、遺傳印跡、惡性腫瘤發生等過程中發揮不可替代的作用［12］。基因啟動子甲基化與糖尿病腎病也存在密切關系，糖尿病腎病患者基因組整體甲基化水平較單純糖尿病患者明顯升高，基因啟動子甲基化可能通過引起炎性損傷、氧化應激、腎臟纖維化、腎細胞凋亡等參與糖尿病腎病發病過程［13］。

Tab.5 Efficacy of MTHFR gene methylation combined with urinary microalbumin and eGFR in the diagnosis of diabetic nephropathy in patients with type 2 diabetes表5 MTHFR基因啟動子甲基化、尿微量白蛋白、eGFR及聯合檢測對2型糖尿病患者發生糖尿病腎病的診斷效能

MTHFR是一碳代謝過程中葉酸代謝的關鍵酶，MTHFR將5,10-亞甲基四氫葉酸轉化為5-甲基四氫葉酸，參與DNA 甲基化相關的葉酸和Hcy 的轉化過程，MTHFR酶活性降低會導致甲基化受損以及葉酸缺乏［14］。MTHFR 在Hcy 轉化為甲硫氨酸過程中必不可少，MTHFR基因編碼Hcy代謝所需的亞甲基四氫葉酸還原酶，MTHFR基因多態性可導致Hcy水平增加［15］。研究顯示，MTHFR啟動子中DNA 甲基化水平與遲發性阿爾茨海默?。?6］、精神分裂癥、重度抑郁癥、自閉癥和雙相情感障礙［17］、食管癌對5-氟尿嘧啶化療的敏感性［18］等均有關。Yang 等［19］研究顯示，健康受試者、單純糖尿病者、早期糖尿病腎病者、晚期糖尿病腎病者MTHFR基因啟動子甲基化水平逐漸降低，非甲基化水平逐漸升高。本研究結果亦顯示，腎病組MTHFR基因啟動子甲基化水平低于單純糖尿病組和對照組，且隨著慢性腎臟病分期增加而降低，MTHFR基因化水平降低是糖尿病腎病發病的危險因素之一，表明糖尿病腎病患者MTHFR基因呈去甲基化狀態，MTHFR基因去甲基化與糖尿病腎病發病有關。分析MTHFR基因啟動子甲基化參與糖尿病腎病的機制可能為：MTHFR基因啟動子去甲基化改變MTHFR 活性，阻斷5,10-亞甲基四氫葉酸向5-亞甲基四氫葉酸的轉移，影響蛋氨酸循環，誘導Hcy 聚集，Hcy 聚集進一步影響蛋氨酸循環，繼而控制甲基化轉移抑制甲基化，形成惡性循環［19］。Hcy水平升高與尿白蛋白排泄增加有關，是2型糖尿病患者早期腎損傷的標志物［20］。因此，MTHFR基因啟動子去甲基化可能通過升高Hcy水平而參與糖尿病腎病發病過程。本研究ROC曲線分析結果顯示，MTHFR基因啟動子甲基化水平診斷糖尿病腎病的AUC 與尿微量白蛋白接近，略低于eGFR，表明MTHFR基因啟動子甲基化在糖尿病腎病診斷中具有一定價值，可能為2 型糖尿病患者早期腎損傷診斷提供參考。聯合三項指標后AUC明顯擴大，提示臨床可將MTHFR基因啟動子甲基化、尿微量白蛋白、eGFR 聯合用于糖尿病腎病診斷，以提高早期診斷率。回歸分析顯示，除尿微量白蛋白升高和MTHFR基因啟動子甲基化、eGFR降低外，高血壓也是糖尿病腎病的危險因素，提示高血壓合并MTHFR基因啟動子甲基化、尿微量白蛋白、eGFR 異常患者發生糖尿病腎病風險較高，應做好防范和早期干預。

綜上所述，糖尿病患者MTHFR基因啟動子甲基化水平降低，MTHFR基因低甲基化可能與2 型糖尿病患者發生糖尿病腎病以及疾病程度加重有關。檢測MTHFR基因啟動子甲基化水平有助于糖尿病腎病的診斷。